姜黄素通过抑制ER应激和TNFα/MAPK/STAT3轴减轻草甘膦诱导的乳腺毒性

《Antioxidants》：Curcumin Attenuates Glyphosate-Induced Mammary Toxicity via Suppression of ER Stress and the TNFα/MAPK/STAT3 Axis

　　

姜黄素，一种具有明确抗氧化和抗炎特性的天然多酚，被研究人员评估其对草甘膦（GLY）诱导的乳腺毒性的保护作用。怀孕小鼠通过口服灌胃接受GLY（50或250 mg/kg/天）加或不加姜黄素（150 mg/kg/天）；GLY剂量依赖性地破坏肺泡结构，引起明显的炎症浸润，并下调紧密连接蛋白。同时，山羊乳腺上皮细胞（GMECs）用GLY（1或7 mM）和姜黄素（1 μM）处理以剖析急性细胞应激通路。这些互补模型分别解决GLY毒性的不同方面：体内系统反映明确的口服暴露，而体外设置采用高浓度以探究机制事件。转录组学分析与功能测定相结合表明，GLY触发氧化应激、内质网应激（ER stress）和细胞内Ca²⁺超载，激活TNFα/MAPK轴，抑制STAT3磷酸化，最终促进凋亡。姜黄素共处理在结构和分子水平上减轻了这些改变。这些发现表明，姜黄素可通过恢复细胞稳态和抑制凋亡及炎症信号来对抗GLY诱导的乳腺损伤，从而保护乳腺健康。

**研究背景与问题**
草甘膦（GLY）是一种广泛使用的除草剂，通过抑制莽草酸途径发挥作用，但动物体内缺乏该途径，因此曾被部分监管机构认为对人类安全。然而，越来越多的证据表明，长期低剂量暴露可导致肝、肾毒性，并可能干扰内分泌。国际癌症研究机构（IARC）将其重新分类为可能的人类致癌物，但各国监管存在分歧。乳腺组织对GLY毒性的敏感性尚未被充分研究，乳腺上皮细胞（MECs）是维持血乳屏障（BMB）和泌乳功能的关键。姜黄素（Cur）是一种天然多酚，具有抗氧化、抗炎和抗癌活性，但其对GLY诱导乳腺损伤的保护作用及机制尚不清楚。为此，研究人员建立了体内（孕鼠）和体外（山羊乳腺上皮细胞，GMECs）模型，以探究GLY的乳腺毒性机制及Cur的干预效果。该论文发表在《Antioxidants》。

**主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术：①动物模型：孕鼠从妊娠第15天至泌乳第10天，每日口服灌胃GLY（50或250 mg/kg/天）和/或Cur（150 mg/kg/天），共4组（n=6），小鼠来源为西北农林科技大学动物实验中心SPF级昆明小鼠。②体外细胞模型：从3岁关中奶山羊泌乳期乳腺组织分离GMECs，用胶原酶消化和差速离心法获得。③转录组测序（RNA-seq）：对小鼠乳腺组织和GMECs进行Illumina NovaSeq平台测序，STAR比对，DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs），GO和KEGG富集分析。④组织病理学：HE染色及半定量评分（0-3级）。⑤细胞活力：CCK-8法检测GLY（1-10 mM）和Cur（0.3-2.0 μM）对GMECs的影响。⑥凋亡检测：Hoechst 33258染色和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术。⑦ROS检测：DCFH-DA荧光探针。⑧ER应激和Ca²⁺检测：ER-Tracker Red和Fluo-4 AM荧光探针，ImageJ定量。⑨RT-qPCR和Western blot：检测相关基因和蛋白表达，β-actin作为内参，抗体信息见表2。

**研究结果**
**3.1 乳腺组织病理学**
HE染色显示，L-GLY组（50 mg/kg）出现轻度结构紊乱和少量炎症细胞浸润；H-GLY组（250 mg/kg）肺泡结构严重破坏，肺泡腔内大量炎症细胞浸润；H-GLY+Cur组部分肺泡损伤减轻，炎症浸润轻微。RT-qPCR表明，GLY显著上调IL-6、IL-1β和TNFα mRNA，下调紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-3和Occludin，而Cur共处理可逆转这些变化，提示Cur保护血乳屏障并抑制炎症。

**3.2 损伤乳腺的转录组测序**
对小鼠乳腺组织进行RNA-seq，主成分分析（PCA）显示GLY和GLYCur组与对照组转录模式明显分离。GLY组有596个基因上调、358个基因下调；GLYCur组有1733个上调、1031个下调。GO富集分析显示GLY组DEGs主要与有丝分裂细胞周期相关；GLYCur组富集T细胞激活、白细胞迁移等。KEGG分析显示GLY组富集细胞周期、DNA复制、MAPK信号通路；GLYCur组则富集免疫应答、病毒感染等通路，提示Cur通过调节炎症和基因表达模式减轻GLY损伤。

**3.3 GLY和Cur对GMECs活力的影响**
CCK-8实验表明，GLY（1-10 mM）处理24 h后细胞活力显著下降（p<0.05），而Cur（0.6-1.0 μM）可提高细胞活力，但高浓度（>1.5 μM）反而抑制活力。选择7 mM GLY和1 μM Cur进行后续实验。ROS检测显示，GLY组绿色荧光显著增强，GLYCur组荧光减弱，表明Cur通过抑制氧化应激减轻细胞毒性。

**3.4 GMECs暴露于GLY后的转录谱**
对GMECs进行RNA-seq，PCA显示组间分离。GLY组有832个基因上调、1366个下调；GLYCur组有1554个上调、1922个下调。GO分析显示GLY组富集激素代谢、凋亡正调控、细胞死亡、核糖体生物合成等；GLYCur组富集趋化性调节、细胞增殖正调控等。KEGG分析显示GLY组激活细胞因子-细胞因子受体互作、核糖体生物合成、MAPK信号通路、TNF信号通路等；GLYCur组富集类固醇激素生物合成、干细胞多能性调控通路等。DEGs比较发现GLY显著改变ER应激相关基因（GADD45B、DDIT4、TXNIP等）和凋亡相关基因（BNIP3、RNF183等），Cur部分逆转这些转录失调。

**3.5 Cur减轻GLY诱导的ER应激和Ca²⁺超载**
荧光显微镜显示，GLY组ER结构紊乱，红色荧光增强且弥漫，提示ER肿胀；Cur共处理（GLYCur组）显著降低荧光强度，部分恢复ER形态。Ca²⁺检测显示GLY组绿色荧光剧烈增强，GLYCur组荧光显著减弱。RT-qPCR表明GLY显著上调ER应激标志物GRP78、IRE1、ATF4、CHOP mRNA水平，Cur共处理显著降低这些基因的表达，但部分仍高于对照。结果表明Cur通过恢复ER稳态和Ca²⁺平衡减轻GLY诱导的ER应激。

**3.6 Cur减轻GLY诱导的GMECs凋亡**
Hoechst 33258染色显示，GLY（1 mM和7 mM）处理导致细胞核染色质浓缩、核碎裂，H-GLY组更明显；流式细胞术显示GLY组早期和晚期凋亡细胞比例显著增加，且呈浓度依赖性；Cur共处理显著降低凋亡率。Western blot显示GLY组促凋亡蛋白Bax、caspase-8、caspase-6、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平升高，Cur组显著降低；RT-qPCR显示GLY上调Bax、caspase-8、caspase-6、caspase-3 mRNA，下调抗凋亡基因Bcl-2，Cur逆转这些变化。GLYCur组呈现中间表型，表明Cur部分拮抗GLY的促凋亡作用。

**3.7 Cur通过TNFα/MAPK/STAT3轴拮抗GLY诱导的炎症反应**
Western blot显示，GLY组TNFα蛋白水平及p-MAPK/MAPK、p-STAT3/STAT3磷酸化比例显著升高；Cur组TNFα和p-MAPK水平降低，p-STAT3保持或略高于对照；GLYCur组TNFα和p-MAPK显著低于GLY组，p-STAT3介于两者之间。总MAPK和STAT3蛋白水平稳定。结果表明Cur通过调节TNFα/MAPK/STAT3轴抑制GLY触发的促炎信号。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出，GLY暴露导致乳腺组织呈现类似乳腺炎的病理改变（肺泡破坏、炎症浸润、血乳屏障破坏），伴随ER应激、氧化应激、Ca²⁺超载、凋亡激活及TNFα/MAPK/STAT3炎症通路的上调。Cur通过恢复ER和Ca²⁺稳态、抑制ROS产生、下调促凋亡蛋白和炎症信号，部分逆转这些效应。但研究存在局限性：体内未设Cur单独组，体外高浓度（7 mM）远高于实际暴露水平，且跨物种设计（小鼠体内、山羊体外）需谨慎解读。

结论翻译：总之，研究人员的研究结果表明，暴露于广泛使用的除草剂草甘膦（GLY）会诱导剂量依赖性的乳腺损伤，表现为腺泡破坏、炎症浸润和血乳屏障破坏。体外实验进一步证实，GLY触发氧化应激、内质网（ER）应激和细胞内Ca²⁺超载，这些共同激活线粒体凋亡通路和TNFα/MAPK/STAT3炎症轴。值得注意的是，姜黄素（Cur）共处理通过部分减轻GLY诱导的转录组改变、抑制活性氧（ROS）产生、缓解ER应激、阻止凋亡和抑制炎症信号级联，有效逆转这些病理和分子改变。总体而言，这些结果确立了草甘膦是一种直接的乳腺毒物，能够引起类似乳腺炎的病理变化，并突显了姜黄素——一种天然来源的抗氧化剂——作为减轻草甘膦相关乳腺毒性的有效膳食干预手段。