《Antioxidants》：Effects of Different Temperatures on Flavonoid Secondary Metabolites and Antioxidant Activities of Paecilomyces hepiali
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为探究Paecilomyces hepiali（P. hepiali）在不同温度下的生理与代谢响应机制，研究人员设置了五个温度梯度，结合体外抗氧化测定以及非靶向与靶向代谢组学分析，考察了抗氧化系统与黄酮类次生代谢产物的变化。结果表明，温度显著影响活性物质积累与
为探究Paecilomyces hepiali（P. hepiali）在不同温度下的生理与代谢响应机制，研究人员设置了五个温度梯度，结合体外抗氧化测定以及非靶向与靶向代谢组学分析，考察了抗氧化系统与黄酮类次生代谢产物的变化。结果表明，温度显著影响活性物质积累与抗氧化能力，包括过氧化物酶（POD）、总黄酮、可溶性蛋白及2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)（ABTS）。代谢组学分析揭示各组间代谢谱存在明显差异，黄酮类与酚酸被鉴定为核心响应代谢物。KEGG富集分析显示黄酮类生物合成、亚油酸代谢与花生四烯酸代谢是核心调控通路。研究人员筛选出19种共有差异黄酮类代谢物。相关性分析表明香兰素、隐绿原酸与芥子酸与抗氧化能力呈强相关，是温度诱导P. hepiali抗氧化响应的关键调节因子。本研究证实温度调控P. hepiali的抗氧化系统与黄酮类代谢，为其发酵工业化优化提供参考。
该研究围绕分离自青海河南蒙古族自治县天然冬虫夏草的Paecilomyces hepiali（P. hepiali）展开。冬虫夏草作为青藏高原特有的传统珍稀中药材，其共生与关联真菌群落中包含P. hepiali这一重要菌株，其菌丝体可通过人工深层发酵大规模制备，核心活性成分与天然冬虫夏草高度相似，已被批准用于保健食品及相关研究，具有补肺益肾、增强免疫、抗疲劳、抗氧化、保护肝肾、调血脂及辅助抗肿瘤等药理活性，其中抗氧化作用作为其核心药理活性之一，可清除体内自由基、抑制氧化应激、减轻氧化损伤，在延缓衰老与预防慢性病方面具有重要意义。目前研究表明低温胁迫可显著影响药用真菌的抗氧化能力与次生代谢产物生物合成，但温度调控P. hepiali次生代谢的研究仍缺乏系统性，非靶向代谢组学在该菌不同温度处理对代谢谱影响方面的应用较少，其对温度响应的次生代谢研究不足，且不同温度处理对其黄酮类与酚类化合物生物合成的调控效应尚不清楚。为明确P. hepiali发酵产物的抗氧化能力，阐明低温胁迫对其活性成分的影响并促进该菌株的药用开发，研究人员结合非靶向与靶向代谢组学分析不同温度处理下P. hepiali以黄酮类为主的次生代谢产物变化，利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析筛选温度调控黄酮类生物合成的关键代谢通路，并开展体外抗氧化试验探讨温度诱导的黄酮类变化对其发酵产物抗氧化性能的影响，系统描述P. hepiali黄酮类代谢与抗氧化活性对温度变化的响应，为该类药用真菌的优化发酵与代谢调控提供实验支撑。该论文发表在《Antioxidants》。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：以分离自青海天然冬虫夏草的P. hepiali菌株为样本，设置17 ℃、20 ℃、23 ℃、26 ℃、29 ℃五个温度梯度进行摇瓶发酵培养；通过体外抗氧化能力及相关活性物质测定评估抗氧化性能；采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）进行非靶向代谢组学分析以筛选差异代谢物并注释代谢通路；采用基于多反应监测（MRM）模式的靶向代谢组学对黄酮类及酚酸类代谢物进行精确定量与验证；利用主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、Venn图、火山图、层次聚类热图等进行多元统计与可视化分析；基于KEGG数据库进行功能注释与代谢通路富集分析；采用Pearson相关性分析与Mantel检验探讨代谢物与抗氧化指标间的关联。
3. Results
3.1. Effects of Temperature on Antioxidant Capacity and Active Components of P. hepiali
通过对16项抗氧化相关指标的定量检测，研究人员发现过氧化氢酶（CAT）活性在20 ℃达到峰值，超氧化物歧化酶（SOD）活性在29 ℃最高，过氧化物酶（POD）在17 ℃、20 ℃、23 ℃显著升高，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）在26 ℃达最大。非酶抗氧化剂抗坏血酸（ASA）在23 ℃最高，还原型谷胱甘肽（GSH）在20 ℃最高。总酚（TP）与黄酮含量随温度升高总体下降，17 ℃总酚最高但黄酮最低。甘露醇与腺苷含量波动有限，总多糖（TSP）在17 ℃至26 ℃维持高水平而在29 ℃骤降，可溶性蛋白（SP）随温度升高逐渐增加并在29 ℃达峰。铁离子还原抗氧化能力（FRAP）在17 ℃、20 ℃、23 ℃、29 ℃显著优于26 ℃，ABTS阳离子自由基清除率在26 ℃最高，DPPH自由基清除率随温度升高总体下降且在20 ℃最高，羟基自由基（•OH）清除率在23 ℃与26 ℃高于80%。相关性分析显示总酚与黄酮含量与DPPH•、GSH、CAT呈显著正相关，与ABTS清除活性负相关，表明P. hepiali的抗氧化潜力与内源性代谢物尤其是酚类与黄酮类化合物密切相关。
3.2. Metabolomic Analysis of P. hepiali Under Different Temperatures
非靶向代谢组学共鉴定注释2842种代谢物，以氨基酸及其衍生物占比最高，其次为有机酸、苯及其衍生物、生物碱、杂环化合物、核苷酸及其衍生物、萜类等，其中黄酮类、酚酸、木脂素与香豆素等酚类代谢物合计占5.38%。17 ℃至26 ℃代谢稳定性较高，29 ℃代谢物积累显著改变，26 ℃以氨基酸及其衍生物为主，17 ℃至23 ℃诱导酚酸与生物碱积累并抑制黄酮类生物合成，29 ℃氨基酸消耗与有机酸大量积累并存且黄酮类与酚酸协同积累。PCA显示各温度组明显分离，29 ℃与其他组偏离显著，OPLS-DA模型验证均无过拟合，组间代谢差异显著。
3.3. Screening of Differential Accumulated Metabolites (DAMs) and Hierarchical Cluster Analysis (HCA)
以VIP ≥ 1且p < 0.05筛选差异积累代谢物（DAMs），四个比较组共有167种核心DAMs，涉及氨基酸及其衍生物、有机酸、萜类、酚酸、黄酮类、脂质等17类，其中T29 vs. T26的DAMs最多（386种）。T17 vs. T26中851种DAMs以上调245种、下调606种为主，T20 vs. T26为678种（上调247、下调431），T23 vs. T26为656种（上调191、下调465），T29 vs. T26为805种（上调345、下调460）。黄酮类代谢物在T17与T20主要上调，在T29下调；酚酸中2,4-二羟基苯甲酸在T17特异上调，咖啡酸在T29大量积累；酰基肉碱与核苷酸衍生物在T23与T29高表达，磷脂在T23变化最剧烈，呈现温度依赖性变化。
3.4. KEGG Annotation and Metabolite Enrichment Analysis
KEGG注释显示T17 vs. T26与T29 vs. T26各涉及70条通路，T20 vs. T26与T23 vs. T26各涉及61条通路。黄酮类生物合成通路在T17 vs. T26与T29 vs. T26中存在；亚油酸代谢与花生四烯酸代谢在T17 vs. T26、T20 vs. T26、T29 vs. T26显著富集；三羧酸（TCA）循环通路在T23 vs. T26显著富集。关键代谢物层面，亚油酸与花生四烯酸代谢中15(S)-HETE、9(S)-HODE、9,12,13-TriHOME、9(S)-HPODE、13(S)-HPODE显著上调，卵磷脂、11,12-DHET、5,6-DHET明显下调；黄酮类生物合成通路中去甲基黄腐酚显著上调，黄腐酚与新橙皮苷明显下调；上游苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路中 Anthranilate 增加，Chorismate 与 L-Homophenylalanine 减少，下游异黄酮生物合成中路路通素（Isoformononetin）显著下调，表明温度变化动态调控黄酮类生物合成、脂肪酸代谢及TCA循环等核心通路。
3.5. Combined Analysis of Key Flavonoids and Antioxidant Components
靶向代谢组学共鉴定定量56种黄酮类与酚酸代谢物，筛选出19种共有差异代谢物。香兰素、隐绿原酸、芥子酸在17 ℃大量积累并随升温逐渐下降；3′-甲氧基葛根素与水没食子儿茶素没食子酸酯在23 ℃与26 ℃达最高水平；多数黄酮类在29 ℃显著下降。HCA将其分为两大簇：簇I包括咖啡酸、二氢山奈酚3-O-葡萄糖苷与水杨酸等，低温高丰度并随升温递减；簇II如表没食子儿茶素没食子酸酯、水没食子儿茶素没食子酸酯等在23 ℃与26 ℃主导积累。Mantel检验相关网络显示香兰素、隐绿原酸、芥子酸与FRAP、DPPH•、HO•呈极显著正相关（p < 0.001），而簇II化合物与抗氧化指标相关性弱（p > 0.05）。结果表明26 ℃是P. hepiali黄酮类生物合成的平衡点，高温下真菌可能激活特定黄酮类分支以补偿整体抗氧化能力下降，低温则利于高抗氧化活性黄酮类积累。
讨论部分指出，温度是调控P. hepiali发酵及其菌丝代谢与活性物质合成的关键因素。适度低温（20 ℃）提升CAT活性，17 ℃至23 ℃提高POD以缓解低温脂质过氧化；高温（29 ℃）最大化SOD以消除热致超氧阴离子与氧化损伤；GSH-Px对温度变化不敏感并在26 ℃达峰，其稳定活性依赖持续GSH供给。高温诱导活性氧（ROS）大量积累，显著消耗抗坏血酸（ASA）与还原型谷胱甘肽（GSH）并使含量在29 ℃最低。温度明显调控次生代谢产物积累：低温通过维持苯丙烷代谢酶活性促进总酚合成，高温抑制相关酶活性而降低总酚；黄酮类在20 ℃达峰并与DPPH•、CAT、GSH-Px正相关，作为关键自由基清除剂在温度胁迫下通过调控抗氧化酶活性增强菌丝抗氧化能力；29 ℃总多糖骤降伴随SOD升高与非酶抗氧化剂降低，提示高温抑制多糖合成并促进ROS积累；可溶性蛋白随温升而在29 ℃达峰，是热胁迫下细胞稳态的适应性策略。非靶向代谢组学显示各温度处理下代谢差异明显，29 ℃相较26 ℃差异代谢物最多，表明高温造成最强代谢失衡。KEGG富集表明低温促进黄酮醇与黄酮苷形成，高温重塑异黄酮谱；亚油酸与花生四烯酸代谢普遍富集，脂质过氧化标志物升高与卵磷脂降低证明温度触发ROS积累、脂质过氧化与膜损伤，真菌通过苯丙烷重排启动抗氧化防御，改变菌丝生理与发酵品质。靶向代谢组学进一步表征酚类与黄酮类的温度依赖性积累及其抗氧化相关性，层次聚类将T17/T20归为一类、T29单独分离，显示高低温度下黄酮类生物合成路径不同；香兰素、隐绿原酸、芥子酸低温积累且与FRAP、DPPH•、•OH强相关，主导冷诱导抗氧化提升；芥子酸在23 ℃而非17 ℃达峰，酚酸耐受温和升温而香兰素偏好低温；多数黄酮类在29 ℃锐减，但3′-甲氧基葛根素与水没食子儿茶素没食子酸酯例外，结合29 ℃高SOD与低非酶抗氧化剂，表明真菌在高温下选择性保留部分黄酮类合成以维持基础抗氧化防御。总体而言，26 ℃是P. hepiali黄酮类合成的动态平衡点，低温促进高抗氧化酚酸积累，偏离26 ℃则降低合成效率并重塑代谢谱，为通过精确温控优化发酵产物抗氧化品质提供理论基础。
结论部分翻译如下：
本研究从代谢组学层面阐明了温度对P. hepiali黄酮类生物合成与抗氧化能力的调控作用。结果表明，温度变化重塑了黄酮类生物合成、脂肪酸代谢与TCA循环，以平衡抗氧化物质积累与能量代谢，形成分层抗氧化防御。KEGG富集显示低温与高温均激活黄酮类生物合成，而温度诱导的ROS积累与膜损伤改变了脂肪酸代谢；23 ℃的TCA循环富集保障了充足能量供应。靶向定量进一步证实温度调控酚类与黄酮类积累，关键代谢物香兰素、隐绿原酸与芥子酸与抗氧化能力呈强正相关。综上，P. hepiali采取分层代谢策略以适应温度变化。本工作阐明了药用真菌的热适应机制，并为通过精确温度控制提升发酵产物功能品质提供了理论依据。
