汉黄芩素抑制非小细胞肺癌生长与氧化应激、c-Myc/GPX4下调和铁死亡相关反应

《Antioxidants》：Wogonin Suppresses Non-Small Cell Lung Cancer Growth in Association with Oxidative Stress, c-Myc/GPX4 Downregulation and Ferroptosis-Related Responses

　　

摘要
活性氧（ROS）调节的抗氧化防御与非小细胞肺癌（NSCLC）进展和治疗耐药密切相关。汉黄芩素（WGN），一种来自黄芩（Scutellaria baicalensis）的黄酮类化合物，具有抗肿瘤活性，但其是否与NSCLC中ROS依赖性铁死亡（ferroptosis）和线粒体应激相关仍不完全清楚。研究人员使用A549和BEAS-2B细胞、雄性BALB/c裸鼠A549异种移植瘤、患者来源的NSCLC类器官以及公共转录组队列，通过细胞活力、集落形成、迁移/侵袭、DCFH-DA ROS、JC-1、Annexin V/PI、Fe²⁺和脂质ROS探针、RT-qPCR、Western blotting、免疫荧光、抑制剂拯救以及c-Myc功能获得和丧失实验进行分析。WGN抑制了A549的生长和运动，对BEAS-2B细胞影响较弱。WGN显著增加细胞内ROS、Fe²⁺积累和脂质过氧化，降低线粒体膜电位，促进Caspase相关凋亡，减少c-Myc/GPX4和SLC7A11，并增加ACSL4。N-乙酰半胱氨酸（NAC）、Z-VAD-FMK和Ferrostatin-1（Fer-1）部分拯救了WGN诱导的损伤。c-Myc过表达部分恢复了GPX4并减少了脂质ROS/Fe²⁺积累，而c-Myc敲低降低了GPX4。异种移植瘤和类器官重现了肿瘤抑制和选定的氧化还原相关分子变化。总之，WGN抑制A549相关的NSCLC表型，与ROS积累、铁死亡相关脂质损伤、线粒体功能障碍相关凋亡以及c-Myc/GPX4下调有关。

**论文解读：汉黄芩素通过氧化应激、c-Myc/GPX4下调及铁死亡相关反应抑制非小细胞肺癌生长**

**研究背景与问题**

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占主要比例。尽管靶向治疗和免疫检查点抑制剂改善了部分患者的预后，但原发性不响应、获得性耐药、复发、转移及治疗相关毒性仍然限制着长期获益。NSCLC应激适应的核心特征是在致癌、代谢和治疗压力下缓冲活性氧（ROS）并维持氧化还原稳态的能力。肿瘤细胞通过重塑抗氧化防御、线粒体功能、抗凋亡信号和微环境适应来存活。将这种适应性氧化还原缓冲转化为致命性氧化损伤的策略，可能为克服NSCLC应激耐受提供有用途径。铁死亡是一种区别于凋亡、坏死和自噬的调节性细胞死亡形式，其特征是铁依赖性脂质过氧化物积累、ROS扩增和膜氧化损伤。SLC7A11/GPX4轴是重要的抗铁死亡抗氧化防御系统，而ACSL4促进多不饱和脂肪酸的活化，增加铁死亡敏感性。c-Myc作为关键癌基因转录因子，参与肿瘤细胞增殖、代谢重编程和氧化应激适应，但其在铁死亡中的作用并非单向。汉黄芩素（WGN）是黄芩（Scutellaria baicalensis）的主要黄酮类化合物，具有抗炎、免疫调节、氧化还原调节和抗肿瘤活性，但其在NSCLC中是否通过ROS依赖的铁死亡和线粒体应激发挥作用尚不完全清楚。因此，本研究旨在评估WGN是否通过ROS积累、脂质过氧化、铁死亡相关反应和线粒体凋亡来抑制NSCLC。

**主要关键技术方法**

研究人员采用A549细胞（人肺腺癌细胞系）和BEAS-2B细胞（正常支气管上皮细胞）作为体外模型，并建立雄性BALB/c裸鼠A549皮下异种移植瘤模型和患者来源的NSCLC类器官（来自去标识化肿瘤样本）。公共转录组队列包括GSE19188、GSE19804、GSE30219和GSE31210。主要技术包括：CCK-8细胞活力测定、集落形成实验、划痕愈合实验、Transwell迁移/侵袭实验、DCFH-DA荧光探针检测ROS、JC-1染色检测线粒体膜电位、Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测凋亡、RhoNox-6探针检测Fe²⁺、BODIPY 581/591 C11探针检测脂质过氧化、RT-qPCR和Western blotting检测mRNA和蛋白表达、免疫荧光染色、抑制剂拯救实验（NAC、Z-VAD-FMK、Fer-1）以及c-Myc过表达和siRNA敲低功能实验。

**研究结果**

**3.1 Wogonin抑制NSCLC细胞生长和运动，对BEAS-2B细胞影响较弱**
通过CCK-8实验发现，WGN在24小时和48小时均浓度依赖性降低A549细胞活力，且48小时抑制作用更明显，而对BEAS-2B细胞活力影响较小。集落形成实验显示WGN减少A549细胞集落数量。划痕实验和Transwell实验表明WGN减缓伤口闭合，减少迁移和侵袭细胞数量。Western blotting显示WGN上调E-cadherin蛋白表达，RT-qPCR显示下调MMP9 mRNA表达，提示抑制迁移/侵袭可能与增强细胞黏附和减少细胞外基质降解有关。

**3.2 Wogonin促进ROS积累和ROS相关的线粒体功能障碍及凋亡**
DCFH-DA荧光成像和流式细胞术显示WGN浓度依赖性增加细胞内ROS水平。NAC预处理降低WGN诱导的ROS信号并部分恢复细胞活力，表明ROS积累是功能性的损伤因素。JC-1染色显示WGN处理后红色荧光减弱、绿色荧光增强，红/绿荧光比值降低，表明线粒体膜电位丧失。Annexin V/PI流式细胞术显示WGN增加凋亡细胞比例，Z-VAD-FMK部分缓解WGN引起的活力下降。RT-qPCR和Western blotting分别显示CASP3 mRNA和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平升高，支持ROS相关的Caspase依赖性凋亡。

**3.3 Wogonin破坏抗氧化脂质过氧化物防御并引发铁死亡相关改变**
RhoNox-6流式细胞术显示WGN增加A549细胞内Fe²⁺水平。BODIPY 581/591 C11检测显示WGN增强脂质ROS/脂质过氧化信号。RT-qPCR显示WGN降低GPX4和SLC7A11 mRNA表达，升高ACSL4 mRNA表达。Western blotting显示WGN降低c-Myc、GPX4和SLC7A11蛋白表达，升高ACSL4蛋白表达。免疫荧光验证了c-Myc和GPX4蛋白信号减弱。这些结果表明WGN与c-Myc/GPX4相关抗氧化防御减弱、脂质ROS积累和Fe²⁺相关氧化损伤有关。

**3.4 Fer-1部分拯救WGN诱导的铁死亡相关脂质损伤**
Fer-1（一种自由基捕获抗氧化剂和铁死亡抑制剂）预处理部分恢复WGN引起的细胞活力下降，减少WGN诱导的脂质过氧化信号和Fe²⁺相关荧光信号。分子水平上，Fer-1在一定程度上逆转WGN诱导的GPX4降低和ACSL4升高。Fer-1的部分拯救与Z-VAD-FMK的部分拯救共同提示WGN诱导的损伤涉及铁死亡相关脂质过氧化和Caspase相关凋亡，而非单一死亡途径。

**3.5 c-Myc功能获得和丧失实验支持GPX4相关的氧化还原防御反应**
c-Myc过表达质粒转染后，RT-qPCR验证mRNA水平显著升高。Western blotting显示在WGN处理下，c-Myc过表达部分恢复GPX4蛋白水平，并减轻WGN诱导的细胞活力下降、Fe²⁺积累和脂质ROS水平。相反，siRNA介导的c-Myc敲低降低c-Myc表达，伴随GPX4表达下降。这些结果支持c-Myc/GPX4相关轴在WGN诱导的抗氧化脂质过氧化物防御破坏中具有功能关联。

**3.6 公共转录组分析支持MYC/GPX4相关状态在NSCLC中的氧化还原和临床相关性**
整合GSE19188、GSE19804、GSE30219和GSE31210队列，发现MYC和GPX4在NSCLC肿瘤组织中表达异常。以MYC为锚点的Spearman相关热图显示MYC与GPX4及多个铁死亡、氧化应激/脂质过氧化、线粒体凋亡相关基因相关。在GSE30219队列中，GPX4与TFRC、SLC7A11、MKI67和PCNA相关。GPX4高表达组与低表达组在铁死亡驱动、ROS响应、脂质过氧化和迁移/侵袭功能评分上存在差异。Kaplan-Meier生存分析和Cox回归显示MYC、GPX4和铁死亡倾向网络与NSCLC临床结局有一定关联。

**3.7 Wogonin在体内抑制异种移植瘤生长并重现关键氧化还原防御变化**
A549皮下异种移植瘤模型中，WGN治疗组（60 mg/kg/d，腹腔注射，连续8天）与Vehicle组相比，终点肿瘤体积和重量显著减小，肿瘤生长曲线显示WGN减缓生长。治疗期间小鼠体重无明显下降，H&E染色未见明显异常形态学变化。免疫组化和免疫荧光显示WGN处理后肿瘤组织中Ki67和PCNA信号降低，E-cadherin表达升高，c-Myc和GPX4表达降低。这些结果支持体内抗肿瘤活性伴随c-Myc和GPX4降低。

**3.8 Wogonin在NSCLC类器官中保持活性并重现氧化还原相关反应模式**
患者来源的NSCLC类器官经WGN处理后，明场图像显示形态变化（尺寸减小、结构松散、碎片增加）。ATP生物发光法检测显示类器官活力随WGN浓度升高而降低。免疫荧光显示WGN降低c-Myc和GPX4表达，升高ACSL4表达，与二维细胞模型结果一致。

**3.9 提出的ROS中心工作模型**
综合结果支持一个ROS中心模型：WGN不通过单一途径诱导细胞损伤，而是与铁死亡相关脂质损伤和线粒体功能障碍相关凋亡协同作用。在铁死亡分支中，WGN伴随c-Myc和GPX4降低、脂质ROS积累和Fe²⁺相关氧化损伤；在凋亡分支中，ROS积累伴随线粒体膜电位丧失、Caspase活化和凋亡增加。NAC、Z-VAD-FMK和Fer-1各自仅产生部分拯救，提示WGN诱导的细胞损伤反映ROS积累、线粒体凋亡和铁死亡相关脂质氧化损伤的共同参与。

**总结与讨论**
本研究显示，WGN抑制A549相关的NSCLC表型，与ROS积累、铁死亡相关脂质应激和线粒体功能障碍相关凋亡有关。WGN处理伴随c-Myc/GPX4抗氧化保护减弱、脂质ROS增加和Fe²⁺相关细胞损伤。SLC7A11下调和ACSL4上调进一步支持铁死亡允许的分子状态。c-Myc过表达部分恢复GPX4并减轻铁死亡表型，c-Myc敲低降低GPX4，表明c-Myc与GPX4相关抗氧化防御在A549细胞中存在功能关联，但未证明直接转录调控。公共转录组数据支持MYC/GPX4相关状态在NSCLC中的临床相关性。体内和类器官模型重现了抗肿瘤活性和关键分子变化。局限性包括：缺乏ChIP-qPCR、双荧光素酶报告实验、GPX4过表达拯救、ACSL4敲低、SLC7A11功能拯救、GSH/GSSG定量和GPX4活性测定，无法确定直接调控链；未进行详细时间进程分析；体内未进行Fer-1拯救和脂质过氧化组织水平测量；主要基于A549细胞，需在更多NSCLC细胞系中验证。此外，其他氧化还原防御途径（如FSP1/AIFM2-CoQ10）可能也参与，但未直接测量。

**研究结论**
本研究证明，WGN在细胞培养、裸鼠异种移植瘤和患者来源的NSCLC类器官中抑制A549相关的NSCLC恶性表型。该效应伴随ROS积累、线粒体膜电位降低、Caspase相关凋亡、Fe²⁺积累、脂质过氧化增加以及c-Myc/GPX4相关抗氧化防御减弱。WGN处理降低c-Myc和GPX4蛋白水平，而SLC7A11下调和ACSL4上调提供了额外的铁死亡相关分子支持。NAC、Z-VAD-FMK和Fer-1各自产生部分拯救，c-Myc过表达和敲低进一步支持c-Myc/GPX4相关状态与WGN诱导的氧化还原变化之间的功能关联。总之，WGN可能抑制A549相关的NSCLC表型，与ROS积累、铁死亡相关脂质损伤和线粒体功能障碍相关凋亡有关，但c-Myc对GPX4的直接调控和更广泛的NSCLC普适性仍需进一步验证。该论文发表在《Antioxidants》。