Rasgrp1介导的EGFR信号减弱支持协调的乳腺发育

《Cells》：Rasgrp1-Mediated Dampening of EGFR Signals Supports Coordinated Mammary Gland Development

　　

青春期的乳腺发育需要紧密协调的上皮细胞增殖、谱系特化和分支形态发生，这些过程受生长因子信号的关键调控。尽管表皮生长因子受体（EGFR）信号对导管发育至关重要，但其活性如何在乳腺上皮细胞（MECs）内被定量控制仍不完全清楚。在此，研究人员将Rasgrp1（一种Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子）鉴定为乳腺上皮中EGFR信号的关键调节因子。利用Rasgrp1缺陷小鼠、原代MEC实验和类器官模型，研究人员证明Rasgrp1缺失导致EGFR–Ras–PI3K–AKT和mTORC1-S6信号升高，从而增强增殖能力和异常的EGF驱动分支。类器官的转录组学分析揭示，EGF信号抑制Wnt/R-spondin依赖的干细胞基因程序，提示过度的EGFR活性破坏干细胞维持。在体内，Rasgrp1缺陷导致导管延长受损、末端芽持续存在和上皮增殖增加，表明乳腺形态发生的空间和时间协调性崩溃。总之，这些发现将Rasgrp1确立为一个信号调节器，减弱EGFR通路活性以支持协调的乳腺发育。这些结果强调了精确信号校准在上皮发育中的重要性，并提示Ras通路调控在组织稳态和疾病中具有更广泛的意义。

乳腺发育是青春期上皮组织重塑的关键模型，涉及导管树形成、分支形态发生和谱系特化，这些过程受生长因子信号网络的精确调控。表皮生长因子受体（EGFR）信号对导管发育至关重要，但其活性在乳腺上皮细胞（MECs）内的定量控制机制尚不完全清楚。Rasgrp1是一种Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子（RasGEF），在T细胞中已知参与Ras激活，但其在上皮细胞中的功能，尤其在乳腺中的角色，此前未被系统研究。研究人员在饲养过程中观察到Rasgrp1缺陷母鼠的幼崽在哺乳期体型较小，且乳腺组织密度降低，这提示Rasgrp1可能参与乳腺发育调控。基于此，该研究旨在阐明Rasgrp1在乳腺上皮细胞中的作用机制，探讨其是否通过调控EGFR信号来影响乳腺的协调发育。该研究发表在《Cells》期刊上。

研究人员利用Rasgrp1敲除小鼠（C57BL/6背景）、原代乳腺上皮细胞（MECs）分离与流式分选、3D Matrigel类器官培养、Western blot检测磷酸化信号、RNA-seq转录组分析、全组织胭脂红染色及免疫荧光等技术，系统探究了Rasgrp1在乳腺发育中的功能。具体方法包括：从4–9周龄小鼠分离MECs，通过流式分选获得基底和腔细胞亚群；在定义明确的生长因子培养基中培养类器官，添加NGS Wnt、Rspo2和EGF以模拟不同信号环境；利用Western blot检测EGF刺激后ERK、AKT和S6的磷酸化水平；通过集落形成实验评估单细胞增殖能力；对类器官进行RNA-seq分析基因表达谱；对小鼠乳腺进行全组织染色和免疫荧光（Ki67、P-AKT）以评估体内形态和增殖。

**3.1. A Role for Rasgrp1 in Mammary Epithelial Cells**
通过RT-PCR和Western blot检测，发现Rasgrp1在MECs中表达，且在基底和腔细胞中均有表达，而在基质细胞中表达极低。Rasgrp1缺陷小鼠的MECs不表达Rasgrp1 mRNA和蛋白。该结果确立了Rasgrp1在乳腺上皮中的表达模式。

**3.2. Rasgrp1 Dampens EGFR–PI3K Signals in MECs as Well as Single-Cell MEC Colony Growth**
对WT和Rasgrp1缺陷MECs进行EGF时间梯度刺激，Western blot检测显示：Rasgrp1缺陷MECs中磷酸化ERK（P-ERK）轻度增强，磷酸化AKT（P-AKT）和磷酸化S6核糖体蛋白（P-S6）显著升高，基线水平即高于WT。集落形成实验中，单细胞在Matrigel中培养7天，Rasgrp1缺陷MECs形成更多、更大的集落，且该效应依赖于EGFR活性（EGFR抑制剂Erlotinib可阻断）。免疫荧光显示Rasgrp1缺陷集落中P-AKT水平升高。结论：Rasgrp1作为EGFR信号的减弱器，抑制PI3K-AKT通路。

**3.3. EGF Potently Impacts Wnt- and R-Spondin-Driven, Stem-like Molecular Programs in Mammary Gland Organoids**
在定义明确的培养基中，类器官分别暴露于RW（NGS Wnt + Rspo2）、EGF或ERW（EGF + Wnt + Rspo2）条件。RNA-seq分析显示，生长因子条件主导基因表达模式，而非基因型。PCA分析表明RW与EGF/ERW条件显著分离。基因聚类分析发现，RW条件下维持干细胞基因程序（如Lgr5、Snai2、Runx2、Tcf4等Wnt靶基因和Wnt配体），而EGF添加后这些基因表达下降。结论：EGF信号强效抑制Wnt/R-spondin驱动的干细胞样分子程序，提示过度EGFR活性可能破坏干细胞维持。

**3.4. Rasgrp1 Deficiency Impacts Coordinated Mammary Ductal Tree Formation**
在类器官分支实验中，FGF2刺激可诱导WT和Rasgrp1缺陷MEC类器官均产生分支（60–80%），而EGF单独刺激仅使Rasgrp1缺陷类器官产生显著分支，WT类器官则保持球形生长。该异常分支现象在5、7、9周龄小鼠的MEC类器官中均观察到。体内全组织染色显示，Rasgrp1缺陷小鼠在5周龄时导管延长显著缩短，11周龄时末端芽（TEBs）数量异常增多（正常应消退）。免疫荧光检测9周龄小鼠导管末端横切面，Rasgrp1缺陷小鼠中Ki67阳性细胞比例显著高于WT，表明增殖持续活跃。结论：Rasgrp1缺失导致乳腺导管树形成时空协调性破坏，表现为导管延长受损、TEB持续存在和异常增殖。

**讨论与结论**
讨论部分指出，Rasgrp1缺失并非简单地增强整体生长，而是产生一种定性不同的表型：导管内异常增殖和TEB持续存在，但总导管长度或细胞数量未增加，表明空间和时间协调性崩溃。可能机制包括：①EGF信号过度激活可抑制Wnt/R-spondin驱动的干细胞程序，过早终止干细胞自我更新，干扰形态发生；②PI3K-AKT信号显著升高可能扰乱基底/腔细胞谱系特化，导致发育不同步。研究结论：Rasgrp1作为信号调节器（signaling rheostat），通过减弱EGFR通路活性，确保乳腺发育过程中干细胞维持、谱系进展和形态发生的协调。该研究强调了精确信号校准在上皮发育中的重要性，并为Ras通路调控在组织稳态和疾病中提供了更广泛启示。