SOX15对猪胚胎干细胞多能性维持的贡献

《Cells》：SOX15 Contributes to the Maintenance of Pluripotency in Porcine Embryonic Stem Cells

　　

理解多能性调控网络在哺乳动物中的进化仍然是发育和干细胞生物学的一个核心问题。虽然啮齿动物模型已定义了多能性的经典核心回路，但这些调控层级在大型哺乳动物中的保守程度尚不清楚。在此，研究人员提供证据表明，SOX15作为一个调节因子，有助于物种特异性调控网络，维持猪胚胎来源干细胞的多能性并保留功能性分化能力。比较序列分析显示，SOX15的HMG结构域在哺乳动物中高度保守，但启动子差异提示了谱系特异性调控进化。转录组分析表明，与小鼠不同，SOX15从2细胞阶段开始显著上调，并在猪外胚层中保持高表达，与多能性建立的关键窗口期一致。在猪胚胎来源干细胞中，稳定的SOX15敲低导致集落完整性降低、碱性磷酸酶活性减弱、增殖受损以及核心多能性基因（包括OCT4和NANOG）下调。此外，SOX15缺失破坏了拟胚体形成并消除了体内畸胎瘤形成能力。这种缺陷可能反映了多能性受损，但也可能归因于移植后细胞存活或增殖适应性的降低。值得注意的是，小鼠模型中类似的扰动并未产生等效的表型，强调了谱系依赖性功能差异。总之，研究人员的发现表明SOX15有助于支持猪多能性网络，并暗示了哺乳动物多能性层级结构的进化可塑性。这些发现超越了以啮齿动物为中心的范式，为多能性网络的进化可塑性提供了更精细的视角，强调SOX15是调控大型哺乳动物原始多能性的关键谱系特化节点。值得注意的是，这些推断基于使用单个已验证的miRNAi构建体的功能扰动；SOX15特异性因果关系的最终确认将需要未来通过独立敲低序列、CRISPR干扰或RNAi抗性拯救实验进行正交通关验证。

本文解读：SOX15在猪胚胎干细胞多能性维持中的物种特异性作用

**研究背景与问题**

在哺乳动物早期胚胎发生和多能性调控网络中，SOX转录因子家族成员占据核心位置。其中，SOX2被广泛认为是维持自我更新和调控细胞命运决定的不可或缺的核心因子，与OCT4协同通过经典的SOX-OCT复合基序激活下游靶基因，构成多能性调控的基础范式。然而，SOX家族G组成员SOX15，因其与SOX2在保守的HMG-box DNA结合结构域具有高度序列同源性，且在小鼠未分化胚胎干细胞（mESCs）中表达，最初被视为SOX2的潜在辅助或冗余因子。确实，在小鼠中，Sox15敲除动物发育正常且可育，仅在特定细胞谱系中表现出轻微的分化延迟，这导致普遍观点认为SOX15在哺乳动物多能性调控中作用相对次要或冗余。

然而，这一结论主要源于以小鼠为中心的研究，是否普遍适用于其他哺乳动物尚不清楚。越来越多的证据表明，啮齿动物与大型哺乳动物（尤其是猪）的多能性调控网络存在显著差异，猪的胚胎发育、外胚层形成和胎盘结构均与小鼠有显著不同。此外，猪多能干细胞（pPSCs）的建立和维持在技术上仍具挑战性，表明猪的多能性调控回路可能依赖于不同的或物种特异性的核心因子。作为进化上相对较晚出现的哺乳动物特异性基因，SOX15可能在不同哺乳动物谱系中经历了功能特化。然而，其在猪早期胚胎发生过程中的动态表达模式及其在猪胚胎来源干细胞中的功能作用尚未被系统研究。这一知识空白限制了我们对猪多能性网络的理解，并阻碍了在猪中建立具有发育全能性的稳定原始多能干细胞系。鉴于猪作为生物医学模型和农业资源的重要性日益增加，阐明这一主要家畜物种的多能性物种特异性调控因子具有重要的生物学和转化意义。然而，一个主要空白仍然存在：这些物种特异性因子如何与经典核心回路在机制上相互作用，特别是SOX15是否通过经典的SOX-OCT复合基序或与核心因子（如SOX2、OCT4）物理相互作用来调控大型哺乳动物的多能性，尚不清楚。

**研究内容、结论与意义**

研究人员开展了系统研究，通过跨物种序列比较、发育转录组学分析和功能扰动实验，揭示了SOX15在猪早期胚胎和胚胎来源干细胞中的表达特征和功能作用。研究利用两种先前建立的猪多能干细胞模型——pLCDM（来源于孤雌胚胎）和pEPSC（来源于体内受精胚胎），它们具有不同的发育起源和培养条件，以评估SOX15功能。通过稳定敲低SOX15，研究人员发现其是维持猪胚胎干细胞多能性相关特征所必需的，包括集落完整性、碱性磷酸酶活性、增殖能力、核心多能性基因表达、拟胚体形成和体内畸胎瘤形成能力。这些发现表明SOX15是猪多能性网络中的一个关键节点，具有物种特异性功能，挑战了以啮齿动物为中心的多能性范式，并为优化家畜干细胞技术提供了概念框架。论文发表在《Cells》。

**主要关键技术方法**

本研究采用的关键技术方法包括：1）比较序列分析：利用NCBI数据库获取多物种SOX15蛋白序列，通过MAFFT进行多序列比对，使用IQ-TREE构建最大似然系统发育树。2）发育转录组学分析：从公共数据库GSE139512、GSE112380（猪卵母细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、ICM阶段）和GSE71434、GSE273917（小鼠1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、ICM、外胚层阶段）获取测序数据，使用STAR比对至相应参考基因组，通过featureCounts进行基因定量，计算FPKM值。3）功能扰动实验：构建基于慢病毒的miRNA敲低系统，设计靶向猪SOX15的miRNA序列，通过BLOCK-iT? RNAi Designer工具设计，克隆至pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR载体，再亚克隆至FUW慢病毒骨架，包装慢病毒感染猪胚胎来源干细胞，实现稳定敲低。4）碱性磷酸酶（AP）染色和定量：使用BCIP/NBT试剂盒进行AP染色，通过显微镜观察并计算AP阳性集落率。5）免疫荧光染色：使用特异性抗体（包括SOX15、NANOG、SOX2、OCT4、GATA6、α-SMA、β-TUBULIN）进行染色，Hoechst 33342复染细胞核，通过荧光显微镜观察和ImageJ定量分析。样本来源为实验室先前建立的细胞系（pLCDM、pEPSC）以及从公共数据库获取的序列数据。

**研究结果**

**3.1 SOX15基因的序列特征和进化保守性分析**

通过系统分析猪SOX15基因序列，发现其位于12号染色体，编码序列（CDS）长702 bp，编码234个氨基酸，由两个外显子编码。HMG结构域位于氨基酸残基59-117。与SOX2的HMG结构域比较显示高度相似。跨物种比较发现，HMG结构域长度和相对位置高度保守。启动子区域序列比较显示，猪与其他大型哺乳动物（牛、山羊）的相似性超过60%，而猪与小鼠的相似性仅为48.92%，提示转录调控机制的物种特异性差异。多序列比对显示猪SOX15与小鼠Sox15的相似性为75.32%，与人SOX15为84.12%，与牛和山羊SOX15高达90%。系统发育树显示SOX15在哺乳动物中具有相似的进化轨迹，但与果蝇等节肢动物显著不同。

**3.2 SOX15在猪早期胚胎和多能干细胞中的动态表达**

分析GSE139512数据集发现，SOX15表达从2细胞阶段开始上调，在8细胞阶段达到峰值。GSE112380数据集显示，在外胚层阶段SOX15仍保持高表达。相比之下，小鼠Sox15表达也从2细胞阶段开始上调并在8细胞阶段达到峰值，但在外胚层阶段表达显著降低。这种独特的时空表达模式表明SOX15对猪早期胚胎的去分化状态维持和多能性维持具有潜在贡献。

**3.3 SOX15在不同多能性状态的猪胚胎干细胞中的表达分析**

以猪胚胎成纤维细胞（PEF）作为非多能性对照，通过qPCR和免疫荧光检测pLCDM和pEPSC细胞系中多能性因子（OCT4、SOX2、NANOG）的表达，结果显示两种细胞系均高表达这些核心多能性因子。在严格验证引物扩增效率和内参基因稳定性后，qPCR显示猪胚胎来源干细胞中SOX15的转录本丰度显著超过SOX2。相比之下，小鼠mLCDM细胞中Sox2的表达显著高于Sox15。这表明SOX15与猪胚胎干细胞中多能性相关基因的表达相关，可能参与多能性状态的维持和转变。

**3.4 抗体验证和敲低系统构建**

通过构建HA标签的SOX15过表达载体，在293T细胞中验证SOX15抗体的特异性，显示强共定位，确认抗体可用于猪胚胎干细胞。设计SOX15特异性miRNA序列，构建慢病毒miRNA敲低载体FUW-EGFP-SOX15miR，以FUW-EGFP为对照。感染pLCDM和pEPSC细胞后，48小时观察到EGFP荧光。qPCR验证显示pLCDM-SOX15i细胞中SOX15表达降低75%，pEPSC-SOX15i细胞中降低74%，并维持多代。免疫荧光证实SOX15蛋白水平相应降低。该慢病毒miRNA系统可实现稳定且特异的SOX15敲低。

**3.5 SOX15敲低导致猪胚胎干细胞自我更新和多能性相关特征受损**

在pLCDM和pEPSC细胞中敲低SOX15后，与对照组相比，SOX15敲低细胞生长缓慢，克隆数减少、克隆变小，碱性磷酸酶（AP）阳性细胞减少。统计显示AP阳性率显著差异。细胞倍增时间分析显示SOX15敲低后显著增加。qPCR检测多能性基因表达发现，SOX15敲低后SOX2表达升高，而OCT4和NANOG表达降低，蛋白水平趋势一致。对原始（Na?ve）和启动（Primed）多能性状态标志基因的检测显示，pLCDM-SOX15i组中多能性标志基因表达不同程度降低，Na?ve状态标志基因ESRRB表达降低；pEPSC-SOX15i组中类似。这表明SOX15敲低损害了细胞形态、增殖能力和多能性状态。

**3.6 SOX15敲低导致拟胚体形成异常和三胚层分化失衡**

将pLCDM和pEPSC细胞培养于含15%FBS的培养基中进行悬浮培养以诱导自发分化，第5天形成拟胚体（EBs）。形态观察显示，SOX15敲低细胞形成的EBs数量减少、颜色较浅、直径显著减小。qPCR分析三胚层标志基因表达：分化后的pLCDM-SOX15i细胞中内胚层标志基因SOX17和GATA6表达升高，pEPSC-SOX15i细胞也显示内胚层标志高表达；中胚层标志基因PECAM和TAGLN表达无显著变化；外胚层标志基因GFAP表达降低。将EBs转移至明胶包被板继续自发分化7天后，免疫荧光检测三胚层标志物α-SMA（中胚层）、β-tubulin（外胚层）和GATA6（内胚层）。体内畸胎瘤形成实验：将pLCDM对照组、pLCDM-SOX15敲低组、pEPSC对照组、pEPSC-SOX15敲低组细胞（1×10⁷个）皮下注射至约7周龄裸鼠颈部（每组3只），监测4-5周。结果显示，所有注射对照细胞的小鼠均在注射部位形成畸胎瘤（大小5-7 mm），而注射SOX15敲低细胞的小鼠均未形成畸胎瘤。HE染色显示畸胎瘤包含三胚层来源的组织样结构。综上，SOX15敲低削弱了EB形成、畸胎瘤形成和三胚层分化潜能，表现为胚层标志基因表达改变和自发分化异常。值得注意的是，未能形成畸胎瘤可能不仅反映分化能力受损，还反映出移植后细胞存活或增殖的缺陷。

**讨论与结论总结**

讨论部分指出，SOX15长期以来被认为在哺乳动物多能性调控中起次要或部分冗余作用，主要源于小鼠模型中其缺失仅产生微小表型。然而，本研究发现猪SOX15具有物种特异性功能，挑战了以啮齿动物为中心的解释。尽管SOX15与SOX2共享高度保守的HMG-box结构域并能结合OCT4调控SOX-OCT复合基序，但两者间的功能冗余具有物种依赖性。与小鼠不同，猪SOX15从2细胞阶段持续高表达至外胚层阶段，暗示多能性调控层级在啮齿动物与大型哺乳动物间的进化分歧。进化序列分析显示SOX15在大型哺乳动物间的保守性高于猪与小鼠之间，特别是启动子区域，提示转录调控机制的差异可能驱动了功能特化。功能上，SOX15敲低导致集落形态改变、AP活性降低、增殖减慢、核心多能性基因失调。虽然OCT4和NANOG下调及畸胎瘤形成能力丧失表明多能性相关特征受损，但不能排除细胞适应性降低、应激反应或活力下降的贡献。因此，研究结果应被解释为SOX15支持猪胚胎来源干细胞的多能性相关细胞状态，而非直接维持多能性网络的确定证据。SOX15敲低后SOX2表达升高提示补偿尝试，但未能维持OCT4和NANOG，表明SOX15在猪多能性网络中占据非冗余节点位置，不同于小鼠中的功能冗余。此外，SOX15缺失导致内胚层潜能增强而外胚层潜能降低，提示其在猪胚胎发生中可能参与谱系调控。研究局限性包括：缺乏直接跨物种功能验证；依赖单一miRNAi构建体，需要独立敲低序列、CRISPR干扰或RNAi抗性拯救实验确认特异性；实验控制一致性不足，部分功能实验未纳入非靶向miRNA和空载体对照；qPCR数据用于探索性分析而非统计确认，核心结论由增殖动力学、AP活性、EB形成等稳健功能实验和蛋白水平验证支持；未鉴定SOX15的直接靶标、结合位点或相互作用伙伴，未来需ChIP-seq、蛋白质组学和转录组学分析。这些发现强调必须在目标物种中直接研究多能性机制，而非从啮齿动物模型外推；鉴定物种特异性调控因子如SOX15可能有助于优化培养系统并在猪中建立稳定的原始多能干细胞系；理解多能性网络在哺乳动物中的进化为发育可塑性、进化适应和早期胚胎发生的分子逻辑提供了见解。

研究结论部分总结：本研究强调SOX15不仅是一个假定的辅助因子，而是猪多能性程序稳健性的重要贡献者。通过整合进化分析、发育转录组学和功能扰动实验，研究人员证明SOX15与维持自我更新、保持集落完整性、维持畸胎瘤形成所需的细胞适应性以及协调猪胚胎来源干细胞的谱系潜能相关。研究人员指出，SOX15特异性因果关系的最终确认有待未来通过独立敲低序列、CRISPR干扰或RNAi抗性拯救实验验证。这些发现支持谱系特异性适应可以改变单个调控组件的功能贡献的观点。在此背景下，SOX15似乎是一个在大型哺乳动物中获得了显著调控影响的谱系特化因子。虽然研究数据确立了其功能不可或缺性，但精确的分子机制（如特异性基因组占据和蛋白质互作伴侣）需要进一步研究以完全定义其作为谱系特异性调控因子的作用。除了重新定义SOX15的生物学意义，这项工作强调了在目标物种中直接研究多能性的必要性。这种比较方法对于在家畜物种中建立稳健的多能干细胞系统以及构建更符合进化观的哺乳动物发育生物学框架至关重要。