定陶M2汉墓Serpula himantioides的分离、鉴定及其木材降解特性

《International Journal of Molecular Sciences》：Isolation, Identification of Serpula himantioides from Dingtao M2 Tomb and Its Wood Degradation Characteristics

　　

定陶M2汉墓是目前中国发现的规模最大、规格最高、保存最完好的“黄肠题凑”墓葬，对文物保护具有重要意义。在拆卸和保护过程中，观察到沙埋木材构件表面存在广泛的白色丝状真菌污染。为明确优势真菌物种及其对木质文物的影响，研究人员从受污染的木材样本中分离并纯化了优势真菌，并通过分子与形态学方法将其鉴定为Serpula himantioides（ designated as DTW）。研究系统考察了DTW的木材降解能力、纤维素酶活性、Fe³⁺和Ca²⁺对纤维素酶活性的调节作用、全基因组特征以及对抑菌剂的敏感性。结果表明，DTW展现出强大的木材降解能力：接种60天后，木屑的最大力、断裂伸长率和拉伸强度显著下降，分别比对照组下降了88.0%、54.6%和88.6%。菌株DTW定殖的文物微环境富含Fe³⁺和Ca²⁺，在浓度升高时，这两种离子均能显著抑制菌株DTW纤维素酶的活性与比活力。全基因组测序显示，DTW的基因组大小为68,519,434 bp，鸟嘌呤-胞嘧啶（Guanine–Cytosine, GC）含量为44.01%，包含18,373个基因；碳水化合物活性酶和细胞壁降解酶数据库注释证实了其强大的植物细胞壁降解能力。此外，DTW对筛选出的绿色抑菌剂敏感，这些抑菌剂有效抑制了其生长。本研究阐明了定陶M2汉墓沙埋木材上优势真菌的物种及木材降解机制，为该墓葬木质文物的保护提供了理论和技术支持。

木材作为蕴含古代文明直接物理证据的有机文物，其长期地下埋藏不可避免地会受到地化条件与微生物介导的生物降解破坏。其中，木腐真菌凭借广泛的丝状菌丝深入木材基质，是最大且功能最强的木质纤维素分解者。地处菏泽定陶区的定陶M2汉墓属西汉晚期，拥有超过2000年的埋藏历史，是中国迄今发掘的规模最大、等级最高、保存最完好的“黄肠题凑”形制墓葬，具有极高的历史与考古价值。在目前的系统性拆卸与现场保护过程中，鉴于出土饱水木材易发生收缩开裂，保护团队对部分木材采用了沙埋脱水稳定化处理。然而，沙埋木材表面近期出现了广泛的白色丝状真菌污染，这对其承载的不可逆历史信息构成了严重威胁。由于大体积饱水木质文物的真菌病害防治仍是世界性技术难题，为应对这一现场保护挑战，研究人员以沙埋木材为研究对象，开展真菌分离鉴定、木材降解评估、酶学特性分析、全基因组测序与抑菌剂筛选工作。本论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》上，为定陶汉墓木质文物的长期保存提供了理论支撑与可操作的技术方案，也为全球类似饱水木质文物的微生物防治提供了重要参考。

在研究方法上，样本来源于定陶M2汉墓沙埋木材构件表面的污染真菌与木材样本。研究人员利用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基对微生物样本进行分离纯化，并提取DNA通过聚合酶链式反应（PCR）扩增核糖体DNA内部转录间隔区（ITS）进行分子鉴定；通过扫描电子显微镜（SEM）观察菌株形态；采用万能材料试验机测定木屑降解前后的最大力、断裂伸长率与拉伸强度等力学性能；利用试剂盒检测纤维素酶活性与比活力，并通过X射线荧光光谱（XRF）分析木材元素组成；采用单因素方差分析研究不同浓度铁离子与钙离子对酶活性的影响；提取高质量基因组DNA进行全基因组测序，并在碳水化合物活性酶与细胞壁降解酶等数据库中进行基因功能注释；通过含不同浓度绿色抑菌剂的平板培养实验评估菌株的敏感性与生长抑制率。

在研究结果方面，首先进行了优势真菌的分离、纯化与分子鉴定。通过形态学与分子生物学方法，研究人员确认污染木质文物的优势真菌为担子菌门的Serpula himantioides，并将其命名为DTW。SEM观察显示其菌丝有隔膜，不产生孢子，且部分菌丝能交织形成独特的环状结构。这一发现将S. himantioides的已知生态位扩展至考古木材栖息地，表明该环状结构可能有助于菌丝在相对干旱的沙埋微环境中进行黏附与定殖。关于木材降解的研究表明，接种60天后，DTW对木材力学性能造成了严重破坏。与对照组相比，实验组木材的最大力降至229 N，断裂伸长率降至23.36%，拉伸强度降至5.24 MPa，分别下降了明显的比例。这证实了DTW具有极强的木材降解能力，严重削弱了木材的承载能力与韧性，对墓葬结构的稳定性构成严重威胁。在纤维素酶的酶学特性研究方面，DTW被证实能分泌纤维素酶。XRF结果显示木材样本中富含铁与钙元素。通过调节离子浓度发现，高浓度的Fe³⁺（50 mg/L和100 mg/L）以及Ca²⁺（50、100和200 mg/L）均显著降低了纤维素酶活性。这表明真菌富含金属的微环境会通过抑制酶活性来介导降解调控。在DTW的全基因组测序分析中，发现其基因组大小为68,519,434 bp，GC含量为44.01%，共有18,373个基因，且重复序列占比高达43.75%。多数据库注释显示，糖苷水解酶基因最为丰富，且有46个基因在细胞壁降解酶数据库中注释，从基因组层面证实了其强大的植物细胞壁降解能力。最后，对抑菌剂的敏感性研究表明，所选用的异噻唑啉酮类抑菌剂（0.5% K100、0.05% BC01、0.3% BC01、0.5% BC08、3.5% BC08、0.025% BC14和0.5% BC14）均能有效抑制菌株DTW的生长，显示出在文物保护领域的巨大应用潜力。

在讨论与总结部分，研究人员重申了本研究的结论：菌株Serpula himantioides DTW是定陶M2汉墓沙埋木材发生严重生物降解的优势真菌，其具备强大的木材降解能力，且环境中的Fe³⁺与Ca²⁺对其纤维素酶活性具有显著的抑制调节作用，全基因组特征揭示了其降解木质纤维素的遗传基础；筛选出的绿色异噻唑啉酮类生物杀菌剂能有效抑制该真菌生长。研究指出，尽管实验室的静态抑菌筛选验证了即时的抑制效力，但尚未开展关于菌株抗性进化的长期驯化实验，这是当前研究的局限性。这提示在未来的研究方向中，需要结合转录组学与蛋白质组学，深入探究在纤维素酶活性受限的条件下，DTW仍能成功定殖木材的分子机制；需要通过连续继代培养试验评估真菌对抑菌剂的抗性风险；并构建模拟沙埋微环境，测试抑菌剂在复杂原位条件下的长期抗真菌耐久性，从而制定针对真实墓葬环境的有害微生物综合防治策略。该研究为定陶汉墓木质文物的保护提供了坚实的理论支持与绿色抑菌技术途径。