《International Journal of Molecular Sciences》：PseudoVelo: Inferring Gene Expression Derivatives Along Pseudotime as Pseudo-Velocity
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理解细胞分化和转变过程中的单细胞转录动力学是发育生物学的基础。RNA速度（RNA velocity）作为一种推断这些动力学的有价值方法，但受限于其对简化剪接动力学的依赖。作为无动力学依赖的替代方案，基于伪时间（pseudotime）的方法已被开发用于重建细胞转
理解细胞分化和转变过程中的单细胞转录动力学是发育生物学的基础。RNA速度（RNA velocity）作为一种推断这些动力学的有价值方法，但受限于其对简化剪接动力学的依赖。作为无动力学依赖的替代方案，基于伪时间（pseudotime）的方法已被开发用于重建细胞转变。然而，这些方法仅通过将最近邻图的边偏向成熟细胞状态来估计细胞-细胞转变。在此，研究人员提出PseudoVelo，一种计算方法，沿伪时间推断基因表达导数作为“伪速度”（pseudo-velocity）。利用伪时间分析中常用的广义加性模型（Generalized Additive Models, GAMs），PseudoVelo将每个基因的表达拟合为伪时间的函数。然后，通过中心差分近似（central difference approximation），该方法直接计算基因表达相对于伪时间的导数，从而获得每个细胞的伪速度。在多个发育过程上的评估表明，与CellRank 2相比，PseudoVelo表现出强劲性能，能有效利用不同时间先验恢复正确的细胞轨迹，并对多种数据扰动具有高鲁棒性。
**论文解读：PseudoVelo：沿伪时间推断基因表达导数作为伪速度——一种无动力学依赖的细胞动态推断新方法**
**研究背景与问题**
在发育生物学中，理解细胞分化和谱系决定过程中的复杂转录动态是核心目标。RNA速度（RNA velocity）通过分析剪接动力学预测细胞未来状态，已成为一种重要工具。然而，其依赖简化的剪接动力学模型，在复杂系统中可能产生相互矛盾的轨迹，且对数据质量和模型假设高度敏感。作为无动力学依赖的替代方案，基于伪时间（pseudotime）的方法（如CellRank 2）通过偏向最近邻图（nearest-neighbor graph）的边来重建细胞转变，但这类方法仅基于基因表达相似性构建图，不一定反映实际细胞状态间的转变概率，可靠性存疑。因此，亟需一种既能摆脱剪接动力学约束，又能直接量化基因表达变化率的计算方法。
**研究目的与内容**
研究人员开发了PseudoVelo，一种从伪时间直接推断伪速度（pseudo-velocity）的计算框架。该方法利用伪时间分析中常用的广义加性模型（Generalized Additive Models, GAMs）将每个基因的表达拟合为伪时间的平滑函数，再通过中心差分近似（central difference approximation）计算基因表达相对于伪时间的导数，从而获得每个细胞的伪速度矩阵。该矩阵完全兼容传统RNA速度的下游分析工具。研究在多个发育数据集上评估了PseudoVelo的性能，并与CellRank 2进行了定量比较，包括交叉边界方向正确性（Cross-Boundary Direction Correctness, CBDC）、局部投影一致性（Local Projection Consistency, LPC）和初始/终端状态准确性（Initial/Terminal State Accuracy, ITSA）等指标。此外，还测试了不同时间先验（扩散伪时间Diffusion Pseudotime, DPT 和 CytoTRACE评分）以及多种数据扰动（重新聚类、细胞子采样、基因子采样）下的鲁棒性。
**主要结论与意义**
PseudoVelo在多个数据集上均优于CellRank 2，能生成更平滑、更连贯的发育流场，并有效恢复正确的细胞轨迹。其性能对不同时间先验具有高度一致性，且对数据扰动表现出高鲁棒性。当输入错误的时间先验时，PseudoVelo能灵敏地反映这一错误，而CellRank 2则表现出接近随机噪声。该工作为发育生物学提供了一种简洁、有效的细胞动态推断工具，无需依赖简化的剪接动力学模型，具有重要的方法学意义。论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。
**主要技术方法**
PseudoVelo的核心技术方法包括：① 基于广义加性模型（GAMs）的基因表达动态拟合，采用B样条基函数（B-spline basis functions）和对数连接函数（log link function），并引入自适应结分配机制（adaptive knot allocation）以适应不同细胞亚群的时间跨度；② 通过中心差分近似（central difference approximation）进行数值微分，计算基因表达关于伪时间的导数，时间扰动步长严格关联于全局时间跨度；③ 针对细胞亚群的自适应拟合机制，动态调整样条自由度，防止过平滑或欠拟合；④ 利用多进程并行化（multiprocessing）提高计算效率。样本队列来源：小鼠红细胞成熟（Mouse gastrulation erythroid lineage, 9815 cells, from Pijuan-Sala et al.）、斑马鱼早期胚胎发生（Zebrafish embryogenesis, 2341 cells, from Farrell et al.）、小鼠胰腺内分泌发生（Mouse pancreatic endocrinogenesis, from Bastidas-Ponce et al.）、人类造血（Human bone marrow CD34+ cells, from Setty et al.）。
**研究结果**
**2.1 PseudoVelo的设计：通过数值微分拟合基因表达动态并推断导数**
研究人员开发了PseudoVelo计算框架，核心是建立伪时间与基因表达之间的连续统计映射，然后利用数值微分估计每个基因的瞬时变化率。首先，采用带对数连接函数和B样条基函数的广义加性模型（GAMs）对每个基因的表达进行非线性拟合。当存在细胞亚群标签时，自适应拟合机制在亚群水平应用，防止过平滑。然后，通过中心差分近似计算伪速度，时间扰动步长与全局时间跨度相关。为了定量评估，设计了三个指标：交叉边界方向正确性（CBDC）、局部投影一致性（LPC）和初始/终端状态准确性（ITSA），均在转变概率矩阵水平评估，以确保公平比较。
**2.2 PseudoVelo在红细胞成熟过程中利用不同时间指标推断伪速度**
在小鼠原肠胚红细胞成熟数据集（9815个细胞，2000个高度可变基因）上，使用扩散伪时间（DPT）和CytoTRACE评分作为时间先验。与CellRank 2相比，PseudoVelo生成的流线图更平滑、更连贯，CBDC指标显著更高（DPT: 0.91 vs 0.59；CytoTRACE: 0.87 vs 0.56），LPC中位数接近1.0（0.99），而CellRank 2的LPC中位数仅为0.61和0.48。跨时间先验的一致性评估显示PseudoVelo具有高稳定性（中位一致性0.99），略高于CellRank 2（0.95）。这表明PseudoVelo能捕获不同伪时间背后的共同发育动态。
**2.3 PseudoVelo在斑马鱼胚胎发生分支轨迹中推断伪速度**
在斑马鱼早期胚胎发生的中轴中胚层谱系（2341个细胞）上，该轨迹呈现从早期卵裂细胞到脊索和脊索前板的二分叉。使用DPT和CytoTRACE评分作为时间先验时，CellRank 2对输入指标高度敏感，尤其在DPT分布偏斜时产生混乱轨迹。而PseudoVelo能有效克服DPT的偏斜分布，生成清晰、连贯的流线，准确重建向两个终末状态的分支。CBDC指标上PseudoVelo均优于CellRank 2（DPT: 0.81 vs 0.54；CytoTRACE: 0.74 vs 0.59），LPC中位数分别为0.87和0.73，远高于CellRank 2的0.27和0.19。跨时间先验一致性中位数为1.00，表明PseudoVelo在复杂分支流形上表现优异。
**2.4 PseudoVelo在多种数据和扰动下表现出鲁棒性**
在胰腺内分泌发生和人类造血数据集上，PseudoVelo在CBDC、LPC和ITSA指标上均一致优于CellRank 2。为了系统评估鲁棒性，研究人员测试了三种数据扰动：重新聚类（Leiden算法）、细胞子采样（50%）和基因子采样（50%）。对于线性红细胞轨迹，PseudoVelo的重新聚类结果与基线完全一致；对于分支轨迹，PseudoVelo在所有扰动下均保持高CBDC和LPC得分，优于CellRank 2。当CytoTRACE评分提供错误方向时，PseudoVelo的CBDC显著下降，反映了其对输入错误的敏感性，而CellRank 2则仅微弱下降，表现出随机噪声。在斑马鱼数据中使用错误根节点计算DPT时，同样观察到PseudoVelo的CBDC显著下降。此外，与传统RNA速度方法（scVelo, Cell2fate）比较，PseudoVelo的LPC得分与它们高度可比，远优于CellRank 2。
**讨论与结论**
**讨论部分**：PseudoVelo提供了一种从伪时间推断伪速度的计算框架，通过GAM拟合和中心差分近似，避免了剪接动力学和图的偏向操作。在多个数据集上，与CellRank 2相比，PseudoVelo生成了更有序、局部空间连贯性更强的发育流。鲁棒性分析表明其性能稳定。但存在一些潜在问题：首先，对时间先验的质量敏感，错误先验会直接导致错误结果；其次，自适应拟合机制虽不严格依赖人工注释，但需合理聚类；最后，大规模数据集的计算强度可通过多进程并行化缓解。
**结论翻译**：PseudoVelo提供了一种推断细胞动态的简洁解决方案，代表了发育生物学研究中的一种新型计算工具。通过超越简化的剪接动力学和图操作，PseudoVelo为研究人员配备了一个有效框架，以揭示细胞分化、胚胎发生和更广泛发育过程中复杂的转录动态。
