氨磷汀减轻阿霉素诱导的大鼠亚急性肝和肾毒性

《International Journal of Molecular Sciences》：Amifostine Attenuates Doxorubicin-Induced Subacute Hepatic and Renal Toxicity in Rats

　　

本研究旨在评估氨磷汀（AMI）对接受单次大剂量阿霉素（DOX）处理的大鼠的一般性、肝脏保护性和肾脏保护性作用，并在给药后第7天和第56天进行评估。大鼠被分为六个实验组：对照组（0.9% NaCl腹腔注射（ip））、氨磷汀组（AMI300，300 mg/kg（ip））、阿霉素组（DOX6，6 mg/kg（ip））、阿霉素组（DOX10，10 mg/kg（ip））、阿霉素（DOX6，6 mg/kg（ip））+氨磷汀（AMI300，300 mg/kg（ip）于DOX6前30分钟）组，以及阿霉素（DOX10，10 mg/kg（ip））+氨磷汀（AMI300，300 mg/kg（ip）于DOX10前30分钟）组。在第56天，与仅接受DOX6处理的动物相比，AMI300+DOX6组动物的绝对肝脏和肾脏重量显著增加。在DOX10处理的大鼠组中，AMI300在治疗后四周内显著阻止了白细胞数量的变化。在第56天，预先给予AMI300的大鼠中，DOX6处理组肝脏和肾脏损伤的严重程度也显著降低（p < 0.01）。研究人员的分析表明，肝脏和肾脏保护显著有助于AMI成功对抗DOX诱导的大鼠亚急性毒性。

**论文解读：氨磷汀减轻阿霉素诱导的大鼠亚急性肝和肾毒性**

**研究背景**
阿霉素（DOX）是一种来源于链霉菌（*Streptomyces peucetius*）的蒽环类抗生素，是治疗乳腺癌、淋巴瘤、肉瘤、卵巢癌、甲状腺癌和肺癌等多种癌症的有效化疗药物。然而，DOX具有显著的剂量依赖性毒性，主要包括心脏毒性、骨髓抑制、肝毒性和肾毒性。DOX的毒性机制涉及多个方面：通过DNA嵌入和干扰DNA/RNA合成抑制癌细胞分裂；抑制DNA解旋酶导致DNA断裂和细胞死亡；产生活性氧（ROS）破坏细胞组分（DNA、蛋白质和膜）。在肝脏中，DOX主要被醛酮还原酶（AKR1A）和羰基还原酶（CBR1/CBR3）代谢为活性代谢物阿霉素醇，同时通过单电子还原形成半醌自由基，生成ROS（超氧阴离子O₂^?、羟基自由基OH•、过氧化氢H₂O₂），导致肝细胞凋亡和坏死。在肾脏中，DOX降低主要抗氧化酶（过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD）水平，引发氧化应激，同时促进促炎细胞因子（肿瘤坏死因子-α TNF-α、白细胞介素-6 IL-6）的产生，导致肾小球系膜基质增生、胶原沉积、足细胞足突融合，最终引起蛋白尿和肾功能下降。

目前存在的问题是，DOX的肝毒性和肾毒性严重限制了其临床使用，而现有的保护策略尚不完善。氨磷汀（AMI）是一种半胱胺衍生物，具有细胞保护特性，常用于减轻化疗和放疗的副作用，被誉为细胞保护的“金标准”。AMI通过细胞质膜碱性磷酸酶转化为活性游离硫醇代谢物WR-1065，从而清除自由基、提供氢原子、诱导细胞缺氧、释放与细胞蛋白结合的谷胱甘肽并形成混合二硫化物，保护正常组织免受电离辐射和多种化疗药物的损伤。然而，关于AMI对DOX诱导的肝和肾毒性的保护作用，尤其是在大剂量单次给药后的亚急性阶段，研究数据尚不充分且不一致。因此，本研究旨在评估AMI对单次大剂量DOX给药后大鼠肝和肾毒性的保护作用，并阐明其潜在机制。

**研究内容与结论**
研究人员采用雄性Wistar大鼠（6-8周龄，200-220 g），随机分为六组：对照组（0.9% NaCl ip）、AMI300组（300 mg/kg ip）、DOX6组（6 mg/kg ip）、DOX10组（10 mg/kg ip）、AMI300+DOX6组（DOX6前30分钟给予AMI300 300 mg/kg ip）和AMI300+DOX10组（DOX10前30分钟给予AMI300 300 mg/kg ip）。在给药后第7天和56天分别处死动物，监测一般健康状况、体重、肝脏和肾脏绝对重量、外周血细胞计数（白细胞WBC、血小板PLT、红细胞RBC、血红蛋白HB、血细胞比容HCT等），并进行肝和肾组织的病理组织学检查及半定量评分（肝损伤评分HDS、肾损伤评分RDS）。

结论：AMI（300 mg/kg）在DOX给药前30分钟给予，能够显著减轻DOX（6 mg/kg和10 mg/kg）诱导的亚急性肝和肾毒性，表现为改善动物生存率、减轻体重下降、部分恢复肝脏和肾脏重量、减轻外周血细胞计数的恶化（尤其是白细胞和血小板），并显著降低肝和肾组织损伤的严重程度。病理组织学结果显示，AMI预处理减少了肝细胞空泡变性、坏死、炎性细胞浸润、血管扩张以及肾小管上皮细胞变性、肾小球萎缩和间质纤维化等病变。该研究发表在《International Journal of Molecular Sciences》。

**关键技术方法**
1. 动物模型：雄性Wistar大鼠（来源：塞尔维亚军事医学科学院实验动物部），分为6组，每组16只，分别接受DOX（6或10 mg/kg ip）单次注射，AMI（300 mg/kg ip）在DOX前30分钟给予。
2. 血液学分析：在给药后第7、14、21、28、56天从尾静脉采集血液，使用血细胞分析仪（ERP-9）测定WBC、PLT、RBC、HB、HCT等参数。
3. 病理组织学检查：在给药后第7天和第56天处死动物，取肝脏和肾脏组织，经甲醛固定、石蜡包埋、苏木精-伊红（H&E）染色，在光镜下（400×）观察并采用半定量评分系统（HDS和RDS，0-5分）评估病变严重程度。
4. 统计学分析：连续变量以均值±标准差表示，使用Kolmogorov-Smirnov检验正态性，正态分布数据用单因素方差分析（ANOVA）及Bonferroni事后检验，非正态分布数据用Kruskal-Wallis检验及Mann-Whitney U检验，显著性水平为p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001。

**研究结果**
**2.1. 一般健康状况、体重、肝脏和肾脏重量**
DOX6和DOX10组大鼠出现明显全身虚弱、无力、脱毛和出血性腹泻，DOX10组大鼠在治疗后第4周全部死亡。与对照组相比，DOX6和DOX10组大鼠体重在治疗后第7天显著降低（p < 0.05）。AMI300预处理组大鼠体重显著高于仅DOX10组（p < 0.05），在DOX6组中整个研究期间AMI300预处理组大鼠体重显著高于仅DOX6组（p < 0.05和p < 0.01）。DOX10组大鼠的绝对肝脏和肾脏重量在第7天显著低于对照组（p < 0.01和p < 0.001），而AMI300+DOX6组大鼠在第56天绝对肝脏重量显著高于仅DOX6组（p < 0.01）。

**2.2. 血液学参数**
DOX6组白细胞数量在第7天显著升高并持续至研究结束，AMI300预处理在第1-2周显著阻止了此变化（p < 0.05）。DOX10组白细胞数量在第7天显著降低，之后回升，第14天显著升高，随后逐渐下降至第4周死亡。AMI300+DOX10组白细胞数量未出现显著变化。DOX6组血小板总数显著升高，AMI300预处理在第2周内成功阻止了此变化（p < 0.05）。DOX10组血小板数量在第1周下降约50%，随后回升，AMI300预处理组血小板数量显著高于仅DOX10组（p < 0.05）。DOX6对红细胞和血红蛋白影响较小，DOX10组红细胞在第28天显著低于基线，AMI300预处理组红细胞和血红蛋白值维持于基线水平，在第14天血红蛋白显著高于仅DOX10组（p < 0.05）。AMI300本身对血液学参数无显著影响。

**2.3. 病理组织学检查**
**2.3.1. 肝脏改变**
对照组肝脏组织学正常。AMI300组仅见轻度肝细胞胞浆空泡化和窦状隙水肿。DOX6组肝细胞出现大量胞浆内空泡，肝小叶放射状排列部分丧失，中度水肿和充血，局灶性出血，库普弗细胞肥大。DOX10组肝细胞不规则，胞浆颗粒明显，核多形性，核仁突出，血管扩张，弥漫性多形核白细胞（PMNCs）聚集。AMI300+DOX6组肝细胞仅见少量小空泡，放射状排列基本保留，轻度水肿和充血，窦状隙轻度扩张，少量库普弗细胞，血管轻度扩张，周围有散在PMNCs。AMI300+DOX10组肝细胞水肿和空泡变性，核小、不规则、深染，窦状隙大量水肿和充血，中央小叶局灶性出血，库普弗细胞肥大，血管扩张，基底膜不连续，周围PMNCs聚集。

**2.3.2. 肾脏改变**
对照组肾脏组织学正常。AMI300组仅见肾小管上皮细胞轻度水肿。DOX6组肾小管上皮细胞中度空泡变性，血管改变广泛，部分肾小球萎缩，第56天肾小球旁动脉壁增厚伴部分肾小球丢失。DOX10组肾小管上皮细胞退变和减少，间质结缔组织增多，部分样本出现血管周围纤维化早期迹象。AMI300+DOX6组肾小管上皮细胞退变和炎症细胞浸润减轻。AMI300+DOX10组肾小管上皮细胞退变显著减轻，但仍有局灶性炎症和出血。

**2.4. 半定量分析**
**2.4.1. 肝脏损伤评分（HDS）**
AMI300单独应用引起轻微肝脏改变（HDS=0.37±0.51），对照组为0.25±0.46。DOX6组在第56天HDS最高（4.75±0.46），DOX10组在第7天HDS为4.00±0.75（p < 0.001和p < 0.01 vs. DOX6第7天HDS=1.62±0.51）。AMI300+DOX6组在第7天HDS为1.62±0.51，第56天为3.00±0.75。AMI300+DOX10组在第7天HDS为2.75±0.46，显著高于AMI300+DOX6组第7天（p < 0.01）。

**2.4.2. 肾脏损伤评分（RDS）**
AMI300单独应用引起轻微肾脏改变（RDS=0.37±0.51），对照组为0.25±0.46。DOX6组在第56天RDS最高（4.50±0.53），DOX10组在第7天RDS为3.75±0.46（p < 0.001 vs. DOX6第7天RDS=1.37±0.51）。AMI300+DOX10组在第7天RDS为2.50±0.53，显著低于仅DOX10组（p < 0.01）。AMI300+DOX6组在第56天RDS为2.62±0.51，显著低于仅DOX6组第56天（p < 0.01）。AMI300+DOX10组在第56天RDS为3.62±0.51，显著低于仅DOX6组第56天（p < 0.001）。

**结论与讨论**
讨论部分指出，DOX的主要毒性机制涉及氧化应激增加、线粒体功能障碍和炎症反应。AMI通过其活性代谢物WR-1065清除自由基、增强内源性抗氧化防御、抑制NF-κB活化及抗凋亡作用，减轻DOX引起的肝和肾损伤。本研究证实，AMI（300 mg/kg ip）在DOX前30分钟给药，能显著改善大鼠生存率、体重、肝肾功能指标、外周血细胞计数，并减少肝和肾脏结构损伤。病理组织学半定量评分（HDS和RDS）显示，AMI预处理显著降低了DOX诱导的肝和肾病变严重程度，尤其是在第56天。

结论部分翻译如下：基于当前结果，AMI（300 mg/kg）在DOX前30分钟给药，显著减轻了两种剂量（DOX6、DOX10）下DOX的作用。DOX引起的动物生存率、全身体重、肝和肾脏重量变化、外周血细胞计数恶化以及肝和肾脏的结构改变均得到显著改善。总体而言，病理组织学发现表明，AMI给药降低了DOX诱导的肝毒性和肾病相关的肝和肾病变的严重程度，保护了肝细胞以及肾小管和肾小球结构，并有助于改善肝和肾脏组织的完整性。因此，AMI300给药后观察到的所有参数改善可能反映了其抗氧化、抗炎和抗凋亡特性，支持其作为对抗DOX诱导的肝毒性和肾毒性的保护剂的潜在作用。