携带EGFR突变的肺腺癌的微小RNA表达谱：EGFR-TKI联合治疗治疗靶点的识别

《International Journal of Molecular Sciences》：The microRNA Expression Signature of Lung Adenocarcinoma Harboring EGFR Mutations: Identification of Therapeutic Targets for EGFR-TKI Combination Therapy

　　

大约一半的日本肺腺癌（LUAD）患者携带表皮生长因子受体（EGFR）基因突变。因此，EGFR是治疗LUAD最关键的治疗靶点。本研究旨在探索LUAD的新治疗靶点，并进一步改进EGFR抑制剂联合治疗。研究人员利用RNA测序技术，从携带EGFR基因突变的LUAD患者临床标本中构建了微小RNA（miRNA）表达谱。基于该miRNA表达谱，研究人员聚焦于表达下调最显著的miR-206。通过将miR-206转染至EGFR突变细胞系PC9中，并筛选表达受抑制的基因，研究人员在LUAD细胞中寻找其靶基因。在PC9细胞中共有821个基因表达下调。通过对这些基因进行分子分类，研究人员发现其中18个基因与细胞周期密切相关。在这些基因中，研究人员聚焦于细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4），并研究了CDK4/6抑制剂（abemaciclib或palbociclib）与EGFR抑制剂奥希替尼（osimertinib）在LUAD细胞中的协同效应。体外和三维培养分析表明，CDK4/6抑制剂与EGFR抑制剂联合治疗可协同抑制携带EGFR突变的LUAD细胞的增殖。基于miRNA的分析是识别LUAD治疗靶点的优秀策略。持续的分析将揭示增强EGFR抑制剂治疗效果的目标分子。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，每年约230万人确诊、180万人死亡。肺腺癌（LUAD）是非小细胞肺癌（NSCLC）中最常见的亚型，约占所有肺癌病例的60%。在亚洲患者（包括日本患者）中，表皮生长因子受体（EGFR）基因突变的发生率为30%–40%，尤其在日本LUAD患者中约半数携带EGFR突变，使其成为最关键的驱动基因和主要治疗靶点。自第一代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）吉非替尼和厄洛替尼问世以来，虽显著改善患者生存，但耐药不可避免，通常在一线治疗约10个月后出现。耐药机制包括T790M突变（对第一、二代EGFR-TKI耐药）和C797S突变（对第三代EGFR-TKI奥希替尼耐药，发生率约20%）。因此，迫切需要开发新的联合治疗策略以克服或延缓耐药，并寻找新的治疗靶点。微小RNA（miRNA）是一类短单链非编码RNA，单个miRNA可调控大量蛋白编码基因，在癌症中异常表达的miRNA会破坏RNA网络平衡。基于miRNA表达谱寻找关键miRNA及其靶基因，可为LUAD联合治疗提供新思路。

**研究内容**

本研究旨在通过构建EGFR突变阳性LUAD患者的miRNA表达谱，挖掘关键miRNA（miR-206）及其调控的致癌靶基因，并验证EGFR抑制剂与CDK4/6抑制剂联合治疗的协同效应。研究首先利用RNA测序对5例EGFR突变LUAD癌组织和5例正常肺组织进行miRNA测序，构建表达谱，发现miR-206在癌组织中下调最显著。随后在EGFR突变细胞系PC9（EGFR exon 19缺失）和H1975（EGFR L858R/T790M突变）中过表达miR-206，通过功能实验（增殖、周期、凋亡、迁移、侵袭）验证其抑癌作用。进一步通过RNA-seq鉴定miR-206调控的基因，结合通路富集和靶基因预测，筛选出18个细胞周期相关基因，聚焦于CDK4。利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-206直接结合CDK4的3'UTR。最后，在体外二维（2D）和三维（3D）培养体系中，评估CDK4/6抑制剂（abemaciclib、palbociclib）与奥希替尼联合用药的协同效应。该论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。

**主要关键技术方法**

研究采用的主要技术方法包括：1）临床样本来源：鹿儿岛大学医院提供的5例EGFR突变LUAD癌组织和5例正常肺组织；2）RNA测序（Illumina NextSeq 500）构建miRNA表达谱，数据已提交至GEO（GSE330633）；3）利用TCGA、OncoLnc、cBioPortal等公共数据库进行表达和预后验证；4）miR-206过表达（转染precursor）后进行细胞功能分析（XTT法、流式细胞术检测周期和凋亡、Transwell迁移侵袭实验）；5）RNA-seq（GSE332750）结合TargetScan预测、GeneCodis4通路富集筛选靶基因；6）双荧光素酶报告基因验证直接结合；7）Chou-Talalay方法计算联合指数（CI）评估协同效应。

**研究结果**

**2.1 RNA测序为基础的EGFR突变LUAD患者miRNA表达谱**
通过对比5例癌组织和5例正常组织的miRNA测序数据，鉴定出30个在癌组织中表达下调的miRNA（log2 Fold change < -1.0, p < 0.05）。其中miR-206下调最显著，并在TCGA数据集（LUAD整体队列及EGFR突变亚组）中得到验证。

**2.2 miR-206在EGFR突变LUAD细胞系中的功能意义**
在PC9和H1975细胞中过表达miR-206后，XTT实验显示细胞增殖显著抑制；流式细胞术显示G0/G1期细胞比例增加、sub-G1期（凋亡峰）增加；凋亡检测（Annexin V-FITC/PI染色）显示凋亡细胞比例显著升高；迁移和侵袭实验（图S1）表明miR-206抑制细胞迁移和侵袭。结论：miR-206在EGFR突变阳性细胞中具有强抑癌功能，尤其调控细胞周期和凋亡。

**2.3 鉴定miR-206调控的致癌靶基因**
在PC9细胞中转染miR-206后进行RNA-seq，发现821个基因表达下调（Log2 FC < -2.0）。GeneCodis4通路富集分析显示这些基因主要富集于细胞周期和DNA修复通路。从中筛选出18个细胞周期相关基因（CCND1、E2F5、SMC1A、YWHAQ、RBL1、ORC1、MCM6、PKMYT1、CDK4、MCM3、BUB1B、PRKDC、DDX11、TICRR、CDC7、E2F2、ORC6、ATR）。qRT-PCR验证在PC9和H1975细胞中均显著下调。TargetScan预测其中4个基因（CCND1、E2F5、CDK4、YWHAQ）的3'UTR含有miR-206结合序列。鉴于CDK4有临床可用抑制剂，选择CDK4为后续研究对象。

**2.4 miR-206靶基因在LUAD细胞中的表达和临床特征**
在PC9和H1975细胞中，miR-206过表达显著降低CCND1、E2F5、CDK4、YWHAQ的mRNA和蛋白水平。TCGA数据显示，这四个基因在LUAD癌组织（n=516）及EGFR突变亚组（n=64）中的表达均显著高于正常肺组织。Kaplan-Meier生存分析表明，YWHAQ高表达与LUAD患者（整体队列）较差总生存相关，但在EGFR突变亚组中无显著预后意义；CCND1、E2F5、CDK4的表达水平对预后无显著影响。尽管CDK4无预后价值，但因其有临床可用抑制剂，仍作为治疗靶点。

**2.5 miR-206直接调控CDK4**
Western blot显示miR-206过表达后PC9和H1975细胞中CDK4蛋白水平显著降低。双荧光素酶报告基因实验显示，含CDK4 3'UTR野生型结合序列的载体与miR-206共转染后荧光素酶活性显著降低，而缺失结合序列的突变载体无此效应，证实miR-206直接结合CDK4的3'UTR。

**2.6 奥希替尼和CDK4/6抑制剂联合治疗在EGFR突变LUAD细胞中的疗效**
测定abemaciclib和palbociclib在PC9和H1975细胞中的IC₅₀值（abemaciclib: 1.14 μM和0.45 μM；palbociclib: 11.94 μM和11.17 μM）。联合用药（abemaciclib 0.1 μM + 奥希替尼，或palbociclib 1 μM + 奥希替尼）显著降低奥希替尼的IC₅₀（PC9中从1.31 μM降至0.21 μM，H1975中从0.07 μM降至0.003 μM；palbociclib组类似）。Chou-Talalay分析显示，在H1975细胞中，奥希替尼与abemaciclib联合在2D和3D培养中均呈强协同效应（Fa=0.5时CI值分别为0.28和0.062）。结论：联合抑制EGFR和CDK4/6，特别是使用abemaciclib，是EGFR突变LUAD有前景的治疗策略。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，本研究基于miRNA表达谱的策略有效识别了miR-206及其调控的18个细胞周期相关基因。除CDK4外，其他基因如BUB1B（调控LUAD干性并通过Ca²⁺/PI3K/AKT通路促进进展）、CDC7（与化疗协同）、PKMYT1（影响放射敏感性）等已有文献支持其作为潜在靶点。CDK4/6抑制剂（abemaciclib、palbociclib）已在乳腺癌中获批，本研究首次在EGFR突变LUAD细胞中验证其与奥希替尼的协同效应，且abemaciclib效果更优。既往研究也表明abemaciclib可抑制奥希替尼耐药细胞的恶性转化，并延缓耐药发生。本研究为克服EGFR-TKI耐药提供了新策略。

**结论翻译**：研究人员基于RNA测序从EGFR突变LUAD患者中构建了新的miRNA表达谱。在该谱中，miR-206下调最显著。此外，miR-206在EGFR突变阳性细胞中表现出抑癌功能。研究人员搜索了miR-206调控的基因，发现了18个涉及细胞周期相关通路的治疗靶点。由于CDK4是miR-206的直接调控基因，选择了其抑制剂abemaciclib和palbociclib。将奥希替尼与CDK4/6抑制剂联合使用显著抑制了携带EGFR突变的LUAD细胞的增殖。这种基于miRNA的分析能够识别出与EGFR抑制剂奥希替尼具有协同作用的靶分子。研究人员的策略将有助于开发EGFR突变LUAD的新型治疗方案。