用于检测番茄黄化曲叶病毒的间接ELISA方法的开发与初步田间评估

《Viruses》：Development and Preliminary Field Evaluation of an Indirect ELISA Assay for Detecting Tomato Yellow Leaf Curl Virus

　　

番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）是番茄生产的主要威胁，需要适用于早期症状或低病毒载量样本的灵敏、低成本检测方法。重组抗原构型可能影响血清学检测方法的开发，尽管多克隆位点（MCS）衍生中间序列的具体贡献仍不确定。在本研究中，研究人员使用无MCS（MCS-free）直接融合构建体生产了重组Trx-His-外壳蛋白（CP）融合抗原，该构建体保留了Trx-His标签，同时去除了MCS衍生的中间序列，随后进行梯度复性。未进行与含连接子、标签切除或无标签抗原构建体的直接比较。纯化抗原用于免疫家兔，产生高效价多克隆抗体（pAb）。由此建立的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）的理论检测限为1.8 ng/mL，样本稀释后估算的稀释前等效检测限（LOD）为72 ng/mL。该检测方法对番茄粗叶基质表现出良好的耐受性，加标回收率为95.45–100.40%。在32份田间收集样本的平衡面板初步评估中，ELISA吸光度与液滴数字PCR（ddPCR）定量（R² = 0.9819）和植物病情指数值（R² = 0.9774）相关。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）肽段图谱和基于AlphaFold2的建模仅用于为抗原解读提供初步计算背景。该检测方法对烟草曲叶病毒（TbCSV）表现出交叉识别，表明不应将其视为严格的TYLCV物种特异性检测。因此，该检测方法可在测试条件下支持初步血清学筛查，而当需要物种水平鉴定时，分子确认仍必不可少。

**研究背景与问题**
番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）是番茄生产中的主要威胁，由烟粉虱（Bemisia tabaci）传播，导致叶片卷曲、黄化及严重矮化，造成重大产量损失。现有检测方法中，定量PCR（qPCR）和液滴数字PCR（ddPCR）灵敏度高，但依赖核酸纯化、热循环仪器及专业操作人员，限制了基层推广。酶联免疫吸附试验（ELISA）具有高通量、低成本、样本处理简便等优势，适用于大规模血清学筛查。然而，重组抗原的构型设计是影响ELISA性能的关键因素之一。在异源表达系统中，外壳蛋白（coat protein, CP）编码序列常与融合标签及载体来源的中间序列一同表达，这些中间序列（如多克隆位点（multiple cloning site, MCS）衍生序列）对折叠、抗原展示及免疫反应性的影响尚不明确。本研究旨在通过无MCS直接融合构建体生产重组Trx-His-CP融合抗原，制备多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb），建立间接ELISA，并初步评估其在田间样本中的检测性能。该论文发表在《Viruses》。

**主要技术方法**
研究人员采用无MCS直接融合构建策略，将TYLCV CP编码序列（Accession No. ABG73017.1）通过同源重组克隆至pET32a载体，保留N端Trx-His标签，去除标签与CP之间的MCS衍生中间序列。在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，优化条件后纯化包涵体，通过梯度透析复性获得可溶性重组抗原。经SDS-PAGE、Western blot及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定纯度与序列覆盖度。用纯化抗原免疫日本大耳白兔，经抗原亲和层析纯化获得pAb。建立间接ELISA，通过棋盘滴定优化条件，采用四参数逻辑回归（4PL）拟合标准曲线，测定理论检测限（LOD）。利用健康番茄叶粗提液评估基质干扰，优化稀释倍数，进行加标回收与精密度实验。交叉反应性测试包括同属病毒（烟草曲叶病毒，Tobacco curly shoot virus, TbCSV）及异源RNA病毒（番茄花叶病毒ToMV、番茄褪绿病毒ToCV、黄瓜花叶病毒CMV）。初步田间评估采用32份北京地区（2025年冬季至2026年春季）采集的番茄叶片样本，按症状严重程度分为健康、轻度、中度、重度四组（每组8份），同步进行ELISA、ddPCR绝对定量及病情指数（disease index, DI）评分，并用线性回归分析关联性。此外，利用AlphaFold2预测CP单体结构，将LC-MS/MS检测肽段映射至模型，并进行TYLCV与TbCSV的CP序列比对。

**研究结果**
**3.1 重组TYLCV CP抗原的制备、复性与表征**
筛选诱导条件表明，20°C诱导16 h获得最高表达量，重组Trx-His-CP融合蛋白以包涵体形式存在（约48 kDa）。经Ni-NTA亲和层析及梯度复性，从5 L发酵培养液中回收17 mg复性蛋白，ImageJ光密度分析显示纯度约98.8%，Western blot证实抗His单克隆抗体（mAb）识别。LC-MS/MS鉴定出36个TYLCV CP衍生肽段，序列覆盖度85.3%，总蛋白评分323.31，宿主残留蛋白信号低于目标蛋白两个数量级。未检测到的14.7%序列可能与胰酶切割模式及短肽长度有关。

**3.2 pAb制备与ELISA系统建立**
兔E25772的抗血清呈现更稳定的信号衰减曲线，经抗原亲和纯化获得pAb浓度为1.03 mg/mL。Western blot显示pAb在1 μg/mL工作浓度下可检测5 ng以上重组抗原。棋盘滴定优化后，最佳条件为CP包被浓度100 ng/mL、pAb工作浓度10 ng/mL，信噪比（S/N）达9.8。pAb滴定曲线半最大效应浓度（EC_{50_titration}）为3.09 ng/mL。标准曲线在1–500 ng/mL范围内拟合良好（R²=0.999），理论LOD为1.8 ng/mL。Trx对照蛋白的ELISA信号在pAb稀释度1:1000时OD₄₅₀为0.203，低于阳性阈值0.24，表明标签背景反应性较低但未完全排除。

**3.3 间接ELISA的分析性能与初步田间样本评估**
将健康番茄叶粗提液稀释至2.5%时，基质效应降至-1.2%，标准曲线线性良好（R²=0.9985）。在此优化稀释度下，加标回收率为95.45–100.40%，批内和批间变异系数（CV）均低于5.0%。交叉反应性测试显示，检测方法对TYLCV产生强信号，对同属病毒TbCSV产生中等交叉反应信号，对异源RNA病毒（ToMV、ToCV、CMV）无交叉反应。在32份田间样本中，ELISA定性分类与ddPCR结果一致（描述性一致，未用于诊断性能估计）。ELISA吸光度与ddPCR报告的TYLCV DNA浓度呈显著正相关（R²=0.9819，p<0.001），与DI值亦呈强线性相关（R²=0.9774，p<0.001）。考虑40倍稀释因子，实际检测限为72 ng/mL。轻度症状样本（ddPCR浓度296.29–659.93 copies/μL）仍可产生明显显色反应。

**3.4 抗原结构特征与实验数据初步分析**
AlphaFold2预测的TYLCV CP单体模型显示核心区域置信度较高（pLDDT），低置信度区域可能为柔性区。预测的溶剂暴露区域可视化，代表性残基如Gln131、Val122、Asn241、Leu230仅用于空间展示，非实验验证的抗体识别位点。LC-MS/MS检测肽段广泛分布于预测CP结构上，但与天然表面暴露无关。TYLCV与TbCSV的CP序列比对显示约78%氨基酸同一性，可能部分解释交叉反应。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出，本研究采用无MCS直接融合构建生产重组抗原，成功制备pAb并建立ELISA，但未与含MCS或标签切除的构建体进行直接比较，因此不能证明该策略的优越性。保留的Trx-His标签可能产生低水平背景反应，但未完全排除。抗原纯化使用同一融合蛋白，pAb中可能存在抗标签抗体。复性抗原可能未完全再现天然病毒粒子CP的构象状态，抗体可能识别线性或部分暴露表位。ELISA与ddPCR和DI的相关性为经验性关联，而非固定定量关系。对TbCSV的交叉反应表明该检测方法不能严格区分TYLCV与TbCSV，在物种鉴定时需依赖分子检测。田间样本面板为平衡设计，不能用于估计诊断灵敏度、特异性、预测值等参数。与先前报道的TYLCV血清学方法比较，本方法在抗体类型、抗原来源、检测格式、灵敏度终点等方面存在差异，不可直接比较，应视为替代性实验室方法。AlphaFold2模型和LC-MS/MS肽段映射仅作为计算参考，非机制验证。

**结论**（翻译自第5节）：
本研究支持了生产重组Trx-His-CP抗原、制备兔pAb以及建立用于番茄样本初步血清学筛查的间接ELISA的可行性。抗原生产和检测方法开发流程在测试条件下运行正常；然而，本研究结果并未证明无MCS构建体优于其他抗原构型。在测试面板内，检测方法响应与ddPCR报告的TYLCV DNA浓度和症状严重程度评分相关，但对TbCSV的交叉识别表明该检测方法并非严格的TYLCV物种特异性检测。
由于本研究使用了来自同一地理区域、两个采样时期的32份精心平衡的样本面板，未提供诊断灵敏度、特异性、预测值、假阳性或假阴性率或常规操作性能的正式估计。在缺乏与已建立的TYLCV血清学检测方法直接比较的情况下，该方法应被视为一种替代性实验室筛查方法，而非已证明的实用改进。未来的开发应包括直接比较测试、基于更大规模独立或连续收集的有症状和无症状样本的盲法多区域评估、ROC曲线阈值优化、序列特征明确的TYLCV分离株及更广泛的双生病毒面板评估，以及试剂稳定性、操作者间变异、工作流程时长、便携式读数仪兼容性和温度鲁棒性的评估。