HDAC1介导的PKM2去乳酰化修饰调控类风湿关节炎中CIRP诱导的血管生成

《Biochemical Pharmacology》：HDAC1-mediated PKM2 delactylation modification regulates CIRP-induced angiogenesis in rheumatoid arthritis

　　

摘要

类风湿性关节炎是一种慢性自身免疫性疾病，其特征为滑膜增生、炎症细胞浸润以及病理性血管生成，最终导致关节逐渐受损。冷诱导RNA结合蛋白在炎症反应中起着重要作用，但其在类风湿性关节炎相关血管生成中的作用尚不清楚。在本研究中，我们发现通过CIRP基因敲除或使用C23进行药物抑制，可显著减轻佐剂诱导的关节炎模型中的关节炎严重程度，并减少滑膜中的血管生成。体外实验表明，CIRP通过上调C-X-C基序趋化因子受体4和Delta样配体4的表达，促进人脐静脉内皮细胞的管状形成、迁移和侵袭。值得注意的是，用C23阻断细胞外的CIRP可抑制其在人脐静脉内皮细胞中的血管生成作用。进一步的研究显示，敲低Toll样受体4也能抑制CIRP在人脐静脉内皮细胞中的血管生成作用，这说明CIRP是通过TLR4依赖的机制促进血管生成的。随后的机制研究揭示，CIRP可通过TLR4在人脐静脉内皮细胞中上调组蛋白去乙酰化酶1的表达。因此，我们研究了HDAC1在CIRP诱导的血管生成中的作用，发现敲低HDAC1可显著抑制这一过程。此外，CIRP还通过TLR4介导的HDAC1通路促进丙酮酸激酶M2向细胞核转移，并抑制其乳糖化作用。而且，PKM2的K62R突变体能增强其向细胞核的转移并促进血管生成。综合这些结果表明，HDAC1介导的PKM2去乳糖化修饰调控着类风湿性关节炎中的CIRP诱导的血管生成。

引言

类风湿性关节炎是一种慢性自身免疫性疾病，其特征为持续的滑膜炎症、逐渐加重的软骨破坏以及病理性血管生成，最终导致关节变形和功能丧失[1]。病理性血管生成是类风湿性关节炎发病过程中的一个关键早期事件，它是炎症与关节破坏之间的重要纽带[2]。在类风湿性关节炎中，滑膜中异常的、未成熟的、易渗漏的血管形成，有利于大量白细胞浸润，为增殖的滑膜组织提供营养，同时营造出促炎微环境。这种微环境不仅会加剧局部炎症反应，还会推动炎症从急性阶段向慢性阶段转变[3]。在各种血管生成因子中，血管内皮生长因子在类风湿性关节炎中被广泛研究，其表达水平与疾病活动度和影像学进展密切相关[4]、[5]、[6]。然而，调控滑膜血管生成的复杂网络仍未完全明了，尤其是那些可能启动或加剧血管生成过程的新颖的损伤相关分子模式。

细胞外的冷诱导RNA结合蛋白是一种在缺氧和细胞应激条件下会被主动分泌的损伤相关分子模式[7]。近期研究表明，类风湿性关节炎患者的滑膜中CIRP浓度明显高于骨关节炎患者，且这一浓度与类风湿性关节炎的病情严重程度密切相关[8]。C23是一种从CIRP蛋白中提取的寡肽（由111–125号氨基酸残基组成），它能与Toll样受体4竞争结合，从而阻止细胞外CIRP与其结合并使其失去活性[9]、[10]。我们之前的研究已经证明，C23可通过抑制CIRP对成纤维细胞样滑膜细胞的激活，改善大鼠模型中的佐剂诱导的关节炎症状，具有治疗潜力[11]。此外，CIRP基因敲除还能通过维持内皮屏障功能，减轻急性胰腺炎引发的多器官功能障碍[12]。这一发现与以下观察结果一致：系统性给予重组小鼠CIRP会导致C57BL/6小鼠出现肺血管损伤，表现为血管通透性增加、肺泡水肿、白细胞聚集以及促炎细胞因子的产生[13]。总体而言，这些研究都表明细胞外CIRP是类风湿性关节炎发病过程中的重要介质，它既影响炎症反应，也会导致内皮细胞功能异常。不过，CIRP是否直接调控内皮细胞的血管生成作用，还有待进一步系统研究。

越来越多的证据表明，表观遗传修饰，尤其是组蛋白去乙酰化，与类风湿性关节炎的进展密切相关[14]、[15]。在各类组蛋白去乙酰化酶中，组蛋白去乙酰化酶1与炎症反应和成纤维细胞活化有关[16]、[17]。血管生成依赖于内皮细胞的协同生长和迁移，每个内皮细胞都会根据局部信号来决定处于静止状态还是开始形态发生[18]。有研究显示，流动条件会促使HDAC1磷酸化并转移到细胞核外，从而在血管生成过程中促进内皮细胞的形态发生[19]。此外，通过siRNA敲低HDAC1也会抑制人脐静脉内皮细胞的血管生成，因为在应用血管紧张素转换酶抑制剂处理后，这些细胞的管状形成能力会下降[20]。这些研究都表明HDAC1参与血管生成过程，也与类风湿性关节炎有关。另外，HDAC1还具有赖氨酸去乳糖化酶活性[21]。不过，HDAC1介导的去乳糖化作用在类风湿性关节炎相关的血管生成中的作用仍不十分清楚。糖酵解酶丙酮酸激酶M2在多种细胞过程和疾病发病机制中都起着调节作用，包括对TLR依赖的炎症反应和自身免疫性疾病的调控[22]、[23]。先前的研究表明，PKM2的K62位点发生乳糖化后会降低其向细胞核的转移，从而使促炎巨噬细胞的表型发生改变，转向修复状态[24]。此外，PKM2还对血管新生起着重要作用，它能调节内皮细胞间的连接以及细胞的集体迁移行为[25]。不过，PKM2的乳糖化作用是否参与了CIRP诱导的HDAC1介导的血管生成，目前还不清楚。

在本研究中，我们提出这样一个假设：CIRP通过TLR4介导的HDAC1上调作用来促进类风湿性关节炎中的血管生成，进而调控PKM2的乳糖化及其向细胞核的转移。我们在体内和体外模型中采用了遗传学和药理学方法，系统研究了CIRP在血管生成中的作用，并阐明了其背后的分子机制。我们的研究结果不仅为类风湿性关节炎的发病机制提供了新的见解，也为寻找干预该疾病炎症与血管生成恶性循环的治疗靶点提供了依据。

章节摘录

材料

人源活性CIRP（APG886Hu01）购自Cloud-Clone Corp.（美国德克萨斯州凯蒂市），其内毒素含量低于1.0 EU/μg。C23多肽（GRGFSRGGGDRGYGG）则由中国江苏的GenScript公司定制合成。本研究使用的抗体会包括：兔抗DLL4抗体（21584–1-AP）、兔抗PKM2抗体（15822–1-AP）、兔抗HDAC1抗体（10197–1-AP），以及鼠抗CXCR4抗体（60042–1-Ig）（均来自Proteintech公司，用于Western blot和免疫荧光检测）；鼠抗TLR4抗体（66350–1-Ig）（来自Proteintech公司，用于Western blot检测）；鼠抗CD31抗体。

CIRP基因敲除或抑制剂可有效减轻AA小鼠或大鼠的关节炎严重程度，并抑制其血管生成

为了探究CIRP是否与类风湿性关节炎的发病机制有关，我们基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了全身性的CIRP基因敲除小鼠模型。我们在野生型小鼠和CIRP基因敲除小鼠体内注射CFA来诱发关节炎。研究结果显示，CIRP基因敲除能有效减轻踝关节损伤的临床表现（见图1A），同时显著降低AA小鼠的爪部厚度，并减少关节炎指数（见图1B和C）。脾脏指数可以反映全身性的

讨论

病理性血管生成是类风湿性关节炎发展过程中的一个关键早期事件，因为异常的血管形成会促使大量白细胞浸润到滑膜组织中，进而加剧局部炎症反应，持续推动自身免疫功能的紊乱[27]、[28]。在本研究中，我们发现CIRP基因敲除或使用C23进行抑制，都能显著减轻AA模型中的关节炎严重程度，并减少滑膜中的血管生成。体外实验也表明，CIRP是通过某种机制来促进血管生成的

伦理审批

所有动物实验均获得了安徽医科大学动物实验伦理委员会的批准（伦理审批编号：20231746），并且所有实验操作都是按照美国国立卫生研究院关于实验室动物护理和使用的指南来进行的。

CRediT作者贡献说明

冯瑶：论文撰写——初稿撰写、项目管理、资金申请、概念构思。余秋霞：实验研究、数据分析、数据整理。胡忠耀：实验资源提供、方法设计。严双静：实验研究、数据整理。童海阳：实验结果验证、实验监督。郑彦民：实验研究。李东升：实验研究。胡伟荣：软件应用、方法设计。方一龙：实验结果验证、方法设计。魏欣：数据可视化、方法设计。王科：数据整理。赵英杰：论文撰写——

资金支持

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号为82304505、82371575和82272450）以及安徽省优秀科研创新团队项目（项目编号：2025AHGXZK10036）的资助。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本论文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

Feng Yao|Qiuxia Yu|Zhongyao Hu|Shuangjing Yan|Haiyang Tong|Yanmin Zheng|Dongsheng Li|Weirong Hu|Yilong Fang|Xin Wei|Ke Wang|Yingjie Zhao|Renpeng Zhou|Wei Hu

安徽医科大学第二附属医院临床药理学系，中国合肥230601