一种基于单管自催化转录驱动的CRISPR级联反应用于超灵敏mRNA检测

《Biosensors and Bioelectronics》：A One-tube Autocatalytic Transcription-Driven CRISPR Cascade for Ultrasensitive mRNA Detection

　　

摘要

快速识别并精确测定癌症生物标志物对于诊断、分类及治疗干预而言至关重要。传统的分子诊断方法，如聚合酶链反应（PCR），具有较高的灵敏度，但依赖于指数级扩增以及复杂的仪器设备，这限制了其在即时检测中的应用。在本研究中，我们开发了一种转录驱动的CRISPR级联扩增技术，可在30分钟内实现阿托摩尔浓度水平的mRNA单管检测。目标序列诱导的三向连接结构形成后，可生成分裂型的T7启动子，进而启动转录并激活Cas13a酶的切割功能。被激活的Cas13a会切割级联探针并释放新的触发链，从而形成转录驱动的级联扩增回路。该检测方法能够同时检测细胞裂解液中的乳腺癌相关mRNA生物标志物（HBB、KRT17和CD55），在复杂的生物样本中仍能保持良好的检测性能。此外，通过引入多路OR门逻辑设计，可实现并行目标识别，进一步提升检测的可靠性，从而为快速准确的临床诊断提供支持。

引言

信使RNA作为基因表达动态和细胞功能状态的直接指标，在乳腺癌研究中，异常的mRNA表达模式与肿瘤亚型、疾病进展及治疗反应密切相关，因此可作为分子分类和早期诊断的重要生物标志物（Hohmann等人，2025年）。传统的核酸诊断方法通常依赖聚合酶链反应或其他酶促扩增技术来获得高灵敏度的检测结果。尽管这些方法效果显著，但由于依赖于指数级扩增且需要复杂的仪器设备，往往存在反应时间过长的问题，难以在即时检测场景中使用（Aslan等人，2026年；Kreitmann等人，2023年）。

基于CRISPR的生物传感系统通过实现可编程的目标识别以及在等温条件下的稳定运行，解决了诸多技术难题（“CRISPR数字传感：从微纳协作芯片到生物分子检测 | ACS Nano”，无日期）。这类系统利用CRISPR蛋白的切割功能，可降解含有荧光团和淬灭剂的报告分子，从而产生可检测的信号。其中，VI型CRISPR相关蛋白Cas13a能够识别特定的RNA序列并降解周围的单链RNA，因此其在诊断应用中具有极高的灵活性（Tong等人，2024年）。不过，目前大多数基于CRISPR的检测方法仍需经过预扩增步骤才能达到临床所需的灵敏度（He等人，2025年；Zhao等人，2025年）。作为一种创新策略，自催化CRISPR结构将目标识别与反馈驱动的信号传播直接结合在一起，从而减少了预扩增的必要性（Shi等人，2021年）。已有许多级联探针策略被设计出来以实现条件性激活，这说明核酸结构可以被编程为反馈开关，用以驱动自催化反应（Lim，无日期）。然而，由于这些系统依赖于多种有效的核糖核蛋白复合物，且对Cas酶的激活控制不够精准，因此亟需一种上游调控机制来限制反应速率并抑制背景激活现象（Zhang等人，2023年）。与3′-羟基驱动的DNA聚合酶相比，T7 RNA聚合酶由于对启动子的严格依赖性，具有更高的特异性（Gholamalipour等人，2018年；Schaffter等人，2018年）。因此，基于转录的机制为提升反应准确性和系统集成度提供了良好的解决方案。

在本研究中，我们将分裂型T7启动子与CRISPR-Cas13a级联探针系统相结合，构建了一种全新的分析策略。有效的核糖核蛋白复合物组装以及反馈启动过程由多组分协同释放来实现，从而形成了AND门控制的激活机制。与此同时，OR门控制的输入识别模块确保只要存在任何目标生物标志物（HBB、CD55和KRT17），就能产生可检测的信号。这种分层式的逻辑控制架构既实现了严格的激活调控，又拓宽了检测范围，进而提升了检测的稳健性及信噪比。该检测反应在37°C下30分钟内即可完成，且能有效抑制背景信号。最后，通过在乳腺癌细胞系中的检测，验证了该平台的实际应用价值。

章节节选

材料与试剂

LwaCas13a以及10× Cas13a反应缓冲液购自Magigen公司。T7 RNA聚合酶、10×转录缓冲液、rNTPs、RNase抑制剂、DNase I以及经二乙基焦磷酸盐处理的去离子水由上海桑格生物科技有限公司提供。5× DNA上样缓冲液则来自安徽博世生物有限公司。20 bp DNA梯度条和GelRed核酸染料由大连塔卡罗生物公司提供。RNA分离试剂、Total RNA提取试剂、BeyoFast? SYBR Green qPCR混合液（2×）等也由相关公司供应。

该方法的概念框架

现有研究表明，LwaCas13a检测方法的灵敏度主要受其较低的转切速率（kcat≈1）以及活化核糖核蛋白复合物的形成受限所限制，而后者的形成又取决于目标分子的可用性（Fakhr等人，2026年；Son等人，2026年）。在分析物浓度较低时，所产生的荧光信号会与仪器噪声及背景信号混为一谈，从而导致信噪比严重下降。

讨论

得益于沃森-克里克碱基配对的可编程性和可预测性，再加上各类酶和核酸组成的丰富分子工具箱，核酸已从简单的杂交探针发展成为用于生物传感、生物分析及生物医学应用的集成平台。先前的研究已经表明，传统的CRISPR/Cas13a系统在复杂环境中容易发生非特异性激活，且其催化转化率相对较低。尽管存在这些问题

CRediT作者贡献说明

谭玉倩：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，实验验证，方法设计，研究实施，正式分析，数据整理，概念构思。邵尔珠：数据整理，概念构思。何欣：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，实验验证，方法设计，研究实施，正式分析，数据整理，概念构思。张丽：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，研究指导，方法设计，资金获取，概念构思。陈强：

未引用参考文献

CRISPR数字传感，无日期。

利益冲突声明

? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了重庆市自然科学基金的资助（项目编号：CSTB2025NSCQ-GPX1202）。

谭玉倩|何欣|邵尔珠|陈强|张丽|邓世雄

中国重庆400016，重庆医科大学法医学系