《Biosensors and Bioelectronics》：High-specificity gene point mutation detection by PAM-free Cas12a system with double-stranded substrate positioning-unwinding
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摘要CRISPR/Cas12a系统在核酸检测领域具有巨大潜力，但由于其严格依赖原间隔序列相邻基序（PAM），这一特性极大地限制了其在基因点突变分析中的应用，因为已知突变位点中仅有不到2%天然存在相邻的PAM序列。在此，我们开发了一种无需PAM的Cas12a系统——双链底物定位解旋
摘要
CRISPR/Cas12a系统在核酸检测领域具有巨大潜力，但由于其严格依赖原间隔序列相邻基序（PAM），这一特性极大地限制了其在基因点突变分析中的应用，因为已知突变位点中仅有不到2%天然存在相邻的PAM序列。在此，我们开发了一种无需PAM的Cas12a系统——双链底物定位解旋系统（dsPU-Cas12a）。该系统中，未配对碱基对形成的“气泡”结构可释放出部分单链目标链作为结合位点，而多余的辅助链则能促使双链DNA局部解旋，从而形成R环结构。经过优化后，dsPU-Cas12a系统在检测基因点突变时的最低检测限可达0.013%，且在0–10%的突变丰度范围内具备出色的线性度。此外，该系统在检测骨髓增生性肿瘤患者血液样本中的JAK2 V617F突变时也表现出良好的可行性和准确性。这种简单且通用的策略突破了Cas12a的序列限制，为临床基因点突变检测提供了一种高性能工具。
引言
近年来，规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统因其可编程的特异性、旁路切割功能以及与多种检测方法的兼容性，已成为基因组编辑和核酸检测领域的强大工具（Wright等，2016；Nafian等，2025；Jinek等，2012；Gasiunas等，2012；Barrangou和Horvath，2017）。基于功能性DNA的传感平台也被广泛用于高灵敏度的核酸分析（Wang等，2026；Lv等，2025；Zhang等，2025）。在CRISPR效应因子中，Cas12a（原名Cpf1）是一种单一效应因子核酸酶，它能自主将前体CRISPR RNA（pre-crRNA）加工成成熟的crRNA，进而引导Cas12a特异性识别单链或双链DNA底物（Charpentier等，2015；Koonin等，2017；Zetsche等，2017；Kim等，2017a）。Cas12a被双链DNA激活需要满足两个严格条件：其一，目标序列必须通过沃森-克里克相互作用与crRNA间隔序列形成互补配对（Dong等，2016；Li等，2023）；其二，与互补区域相邻的非目标链上必须存在特定的原间隔序列相邻基序（PAM），通常为“5′-TTTV-3′（V = A/C/G）”（Smith等，2020；Chen等，2018；Kim等，2017b；Campa等，2019）。PAM识别不仅有助于Cas12a在双链DNA中定位目标序列，还能促进双链DNA解旋并形成crRNA-目标链双链结构（Jeon等，2018；Yamano等，2017；Sun等，2023；Bagheri等，2024；Swarts等，2017）。双链DNA的逐步解旋与crRNA-目标链的杂交同步进行；一旦形成完整的R环结构，Cas12a就会被激活，依次启动顺式切割（目标链切割）和反式切割（单链DNA的非特异性旁路切割）（Li等，2018、2020、2025；Chen等，2024；Zhu等，2025）。
由于Cas12a被双链DNA底物激活时必须依赖PAM，这一特性极大限制了其在生物传感领域，尤其是基因点突变检测方面的应用（Fonfara等，2016；Breinig等，2019；Ke等，2022；Ghouneimy等，2022；Liu等，2024a）。数据库分析显示，已知的基因点突变位点中仅有不到2%的周围存在PAM序列（Rabinowitz等，2020）。尽管有一些研究人员试图通过构建Cas12a核糖核蛋白复合物或优化反应条件等方式来扩大Cas12a对双链DNA的目标识别范围（Toth等，2020；Liu等，2022；Gao等，2017a；Chen等，2023；Lin等，2023），但这些方法设计复杂，无法普遍应用于所有突变位点。目前大多数研究都集中在改造双链DNA底物上：例如，通过聚合酶链反应、环介导等温扩增或滚环扩增等技术在突变位点附近插入PAM序列（Wang等，2023；Zhu等，2022；Zhou等，2022），但这些方法往往存在背景信号过高的问题；或者通过将双链DNA转化为单链DNA来激活Cas12a（Gao等，2017b；Shi等，2023）——正如我们之前的研究所示，可通过单碱基延伸技术将双链DNA底物上的突变信号转化为单链DNA长度信号以便放大检测。虽然这种方法能够实现无需PAM即可检测低丰度基因点突变，但相应的反应流程较为复杂且耗时（Liu等，2024b）。因此，开发新的双链DNA底物以突破序列限制，对于拓展Cas12a在点突变检测中的应用具有重要意义。
在本研究中，我们基于双链底物定位解旋机制构建了一种无需PAM的Cas12a系统（dsPU-Cas12a）。该系统利用目标序列附近或内部的未配对气泡结构，促使部分单链目标链释放出来，从而触发Cas12a的反式切割活性。通过引入与双链DNA非目标链互补的多余辅助链，可在目标区域形成类似气泡的局部解旋结构，为Cas12a的核糖核蛋白复合物提供特定的结合位点。这种创新的双链DNA底物设计理念，通过精确调控气泡结构，实现了对基因点突变的高特异性和高灵敏度检测（最低检测限达0.013%），为克服CRISPR/Cas12a系统的序列限制、拓展其在核酸生物传感领域的应用奠定了基础。
章节节选
材料与设备
本研究使用的所有寡核苷酸（序列详见表S1）均由上海桑格生物科技有限公司合成并纯化，随后储存在4°C的TE缓冲液中。EnGen Lba Cas12a（Cpf1，LbCas12a）及10×NEBuffer 4购自北京新英格兰生物技术公司。血液DNA提取试剂盒、纯化试剂盒以及无DNase/RNase的去离子水则来自北京天根生物技术有限公司。荧光强度是通过Rotor-Gene Q2 plex HRM仪器测定的。
气泡介导的解旋作用为Cas12a在双链DNA上定位目标提供了位点
如前所述，Cas12a被双链DNA激活时对PAM的严格依赖限制了其应用范围（Smith等，2020）。在双链DNA目标存在的情况下，Cas12a的PAM结合域会与PAM序列结合，然后将赖氨酸残基插入双链DNA中，从而启动双链DNA解旋和crRNA-目标链的杂交过程，同时稳定R环结构（Swarts和Jinek，2019）。因此，为双链DNA解旋创造位点对于实现无需PAM的检测至关重要。
结论
总之，本研究基于双链底物定位解旋机制构建了一种无需PAM的Cas12a系统，该系统能够实现基因点突变的高灵敏度检测。与通过酶解、链置换或其他反应获得的单链DNA底物相比，本研究中提出的含有气泡结构的创新双链DNA底物设计，显著放大了突变型与野生型之间的信号差异。此外，通过引入过量辅助链的策略，进一步提升了检测性能。
CRediT作者贡献说明
刘竹君：概念设计、数据整理、定量分析、监督指导、结果验证、可视化处理、初稿撰写、审稿与润色。王金金：概念设计、数据整理、定量分析、结果验证、可视化处理、审稿与润色。杨正光：定量分析、实验研究。黄 Hegui：资源提供、监督指导。张震：实验研究、监督指导。吴通博：资金筹集、监督指导。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：22474045和82302651）以及中央高校基本科研业务费（华中科技大学编号：2025BR020）的资助。
Zhujun Liu|Jinjin Wang|Zhengguang Yang|Hegui Huang|Zhen Zhang|Tongbo Wu
中国湖北省武汉市华中科技大学同济医学院武汉中心医院药学部，邮编430014
