利用外泌体SERS光谱与机器学习实现胶质瘤放射抵抗的无标记检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Label-Free Detection of Glioma Radioresistance Using Exosomal SERS Spectra and Machine Learning

　　

摘要

胶质瘤属于最难治疗的恶性肿瘤之一。由于大脑结构极为复杂，往往难以实现完全手术切除，因此放疗成为必要的辅助手段。然而，与复发密切相关的放疗耐药性仍然是一个重要的临床难题。目前亟需有效的肿瘤生物标志物和新的检测方法，以便预测治疗耐药性并监测治疗效果。在此，我们首次运用表面增强拉曼光谱技术结合蛋白质组学，分析了已建立的放疗耐药胶质瘤细胞所分泌外泌体的特征光谱模式。我们还发现了放疗耐药性发展过程中蛋白质表达的特定变化，包括与糖酵解相关的蛋白质（ALDOA和GAPDH）以及核糖体相关蛋白质（RPS5和RPLP0）。这些蛋白质与胶质瘤的预后相关。此外，生物信息学分析显示，这四个基因的表达水平与肿瘤恶性程度呈正相关。进一步地，我们建立了基于机器学习的诊断模型——主成分分析结合卷积神经网络（PCA-CNN），用于准确识别来自放疗耐药胶质瘤细胞的外泌体。这些研究结果证实，外泌体是预测放疗耐药性的重要生物标志物。该方法能够快速可靠地评估胶质瘤的放疗耐药性，为个性化精准的临床治疗奠定基础。

引言

胶质瘤具有侵袭性生长特性和恶性生物学行为，属于最难治疗的恶性肿瘤之一，其发病率高、复发率高、死亡率高的同时，治愈率也很低（Zhang等，2023a）。由于颅内结构的特殊性，往往难以实现肿瘤的完全切除。放疗可以消灭或抑制残留的肿瘤细胞，控制疾病进展，因此术后放疗尤为重要（Wang等，2010）。在临床实践中，大多数患者需要接受传统放疗，但这一过程会给他们带来严重的身体和心理痛苦，还可能引发严重的长期并发症。此外，肿瘤细胞在高压环境下可能会对放疗产生耐药性，从而导致治疗效果不佳或疾病进展，这是当前胶质瘤治疗面临的一大挑战。放疗后的影像学变化十分复杂（Chedeville和Madureira，2021）。由于血脑屏障功能受损，传统影像学检查可能会出现不均匀的强化现象，难以区分肿瘤复发与放射性坏死。这两种情况在时间表现和临床症状上相似，通常需要通过组织病理学来区分——但术后患者往往无法再次进行活检（Zhang等，2023b）。目前尚无有效且标准化的方法来筛选可能从放疗中受益的患者或评估治疗效果。因此，开发一种无创方法，准确识别对放疗有反应的患者并评估治疗效果，有望实现精准医疗，改善预后，具有重要的临床价值和应用前景。

开发、检测、表征、应用、分析及优化胶质瘤肿瘤标志物，是实现上述目标的关键步骤。越来越多的证据表明，细胞外小囊泡，包括外泌体，参与了肿瘤的形成、迁移、侵袭以及化疗和放疗等治疗过程（Alix-Panabieres，2020；Ignatiadis等，2021）。与传统组织活检相比，液体活检能够避免肿瘤内的异质性，提供更准确的肿瘤特征信息（Paskeh等，2022）。此外，它还可以以无创且可重复的方式实施，便于大规模筛查和全程监测癌症的发展进程——这对于评估存在多发性转移灶的患者尤为有利（Xia等，2020）。外泌体是一种大小为30-150纳米的双层脂质细胞外囊泡，由多种细胞类型分泌。它们含有蛋白质、脂质以及DNA/RNA，能够介导细胞间通讯。通过这种细胞间通讯，外泌体可以影响多种人类生理和病理过程，如肿瘤形成、迁移、侵袭以及对化疗和放疗的耐药性。鉴于其广泛的影响，外泌体的多功能性近年来推动了其在生物医学领域的诊断、预后评估和治疗应用方面的研究（Khidr等，2025）。因此，通过分析体液中的外泌体来评估胶质瘤的放疗耐药性，不仅具有可行性，还具有重要的临床价值。

表面增强拉曼散射技术在本领域发展迅速，其非破坏性、无创性、高分辨率、检测流程简单、样品需求量少以及适合重复测量的特点使其备受青睐（Jeanmaire和Van Duyne，1977）。该技术在癌症检测方面尤其具有巨大潜力。研究人员已将超灵敏拉曼光谱技术应用于外泌体的检测，试图开发出一种新型、高效且无创的液体活检技术（Cheng等，2025；Tan等，2023）。2025年，加州大学圣地亚哥分校Lingyan Shi的研究团队（Villazon等，2025）设计了一种整合了拉曼光谱与主成分分析-线性判别分析机器学习的分类框架，该框架能够对三种癌细胞系——结直肠癌的COLO205细胞系、黑色素瘤的A375细胞系以及前列腺癌的LNCaP细胞系——的外泌体进行亚型分类，总体准确率高达93.3%。光谱分析还揭示了外泌体脂质组成的差异。这项研究实现了无需标记即可通过拉曼光谱对不同来源癌症的外泌体进行亚型分类，将分子指纹直接与癌症中的脂质代谢特征联系起来，为无创液体活检和早期癌症诊断开辟了新的技术途径。包括大希腊大学Tirinato团队、北卡罗来纳大学教堂山分校Dinggang Shen团队、昆士兰大学Yuling Wang团队以及东南大学Yiping Cui团队在内的多个研究小组，也已成功将拉曼光谱技术应用于检测多种癌症的外泌体，包括肺癌（Shin等，2020）、卵巢癌（Lin等，2020）、结直肠癌（Tirinato等，2012；Wang等，2018）以及胰腺癌（Carnino等，2019）。昆士兰大学Matt Trau的团队则利用适配体功能化的金纳米粒子作为三明治结构中的SERS探针，成功检测出了不同外泌体表型的SERS特征信号（Wang等，2018）。福建师范大学Duo Lin的团队率先将无标记SERS技术应用于评估鼻咽癌患者的放疗反应，以及区分对放疗敏感和耐药的鼻咽癌细胞的外泌体，取得了良好的结果（Wu等，2023）。这些研究共同证明了SERS技术在外泌体检测和分析方面的应用潜力；不过，目前尚未有研究报道过利用拉曼光谱检测胶质瘤来源的外泌体。

在本研究中，我们通过分次辐射处理，从亲本敏感型胶质瘤细胞系U251 RS中培育出了放疗耐药型胶质瘤细胞系U251 RR（见图1a）。随后，我们对来自放疗耐药型和敏感型胶质瘤细胞的外泌体进行了纯化与表征。我们创新性地将基于SERS的光学分析技术与蛋白质组学相结合，用于分析外泌体的特征光谱模式，同时探究与放疗耐药性发展相关的特定分子变化（见图1b）。我们使用了一种定制设计的SERS芯片，该芯片具备热点结构、超疏水表面以及内部标准物质，从而能够实现准确可靠的信号读取。之后，我们利用基于不同外泌体群体SERS信号的机器学习模型，识别出来自放疗耐药型细胞群的外泌体（见图1c）。与此同时，我们还通过生物信息学分析，探讨了外泌体中所含特定成分与胶质瘤放疗耐药性形成之间的生物学关联。

章节节选

化学品与材料

四氯金酸（HAuCl₄）、硝酸银（AgNO₃）、柠檬酸钠、L-抗坏血酸（纯度98%）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、无水乙醇（CH₃CH₂OH）、二氯甲烷（CH₂Cl₂）以及正己烷均购自中国上海的Sigma-Aldrich公司。1-十二烷硫醇则由中国上海的上海益恩化学科技有限公司提供。硅芯片则购自中国浙江的凯华顺盛电子商务公司。

表征方法

本研究使用了以下仪器进行

放疗耐药型胶质瘤细胞系的构建与功能验证

放疗耐药型胶质瘤细胞系U251 RR是通过让亲本细胞系U251 RS每周接受一次辐射处理而培育而成的。随后，我们通过四种互补的检测方法，在体外验证了U251 RR的放疗耐药性：（i）白光成像法，（ii）细胞凋亡检测法，（iii）集落形成检测法，以及（iv）免疫荧光染色法。如图1a所示，U251-RS细胞在受到辐射后，细胞密度会出现剂量依赖性的下降，同时细胞

结论

在本研究中，我们采用了具有疏水性能且可自我校准的SERS平台，结合蛋白质组学分析，系统地研究了来自放疗耐药胶质瘤细胞的外泌体的分子特征。我们在放疗耐药性发展过程中发现了一组差异表达的蛋白质，包括与糖酵解相关的酶类（ALDOA和GAPDH）以及与核糖体相关的蛋白质（RPS5和RPLP0）。与敏感型细胞的外泌体相比，这些蛋白质的

CRediT作者贡献说明

Weng Youliang： 方法设计、概念构思。 Qiu Sufang： 文章撰写与修改、研究指导、概念构思。 Wu Qiong： 文章撰写与修改、初稿撰写、实验研究、资金筹集。 Lin Wanzun： 文章撰写与修改、数据可视化、结果验证、概念构思。 Lin Duo： 文章撰写与修改、实验资源准备、资金筹集、概念构思。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

利益冲突声明

? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本项目得到了以下机构的财政支持：中国国家自然科学基金（项目编号：82302344和12374405）；福建省自然科学基金（项目编号：2023J05246）；福建省杰出青年科学基金（项目编号：2024J010024）；福寿基金会科研项目（项目编号：MFK24011）；闽江学院的“引进人才”科研启动基金（项目编号：MJY23019）；以及福建省高等教育物理学科联盟的支持。

Wu Qiong|Qiu Sufang|Lin Duo|Lin Wanzun|Weng Youliang

中国福建省福州市闽江学院物理与电子信息工程学院，邮编350108