《Biosensors and Bioelectronics》：acDEP-assisted microfluidic chip for ultrasensitive detection of urinary exosomes for non-invasive hepatocellular carcinoma diagnosis
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摘要由于缺乏灵敏且无创的诊断方法，肝细胞癌的早期检测仍然面临挑战。尿液外泌体可作为有潜力的生物标志物来源，但在实现高效快速分离以及即时高灵敏度分析方面仍存在技术难题。为解决这一问题，我们开发了一种基于交流电介电泳的微流控平台，并结合两亲性树状大分子超分子探针，以实现快速灵敏的检测
摘要
由于缺乏灵敏且无创的诊断方法，肝细胞癌的早期检测仍然面临挑战。尿液外泌体可作为有潜力的生物标志物来源，但在实现高效快速分离以及即时高灵敏度分析方面仍存在技术难题。为解决这一问题，我们开发了一种基于交流电介电泳的微流控平台，并结合两亲性树状大分子超分子探针，以实现快速灵敏的检测。在该系统中，由梳形电极产生的非均匀交变电场通过正介电泳作用将外泌体驱动至经过ADSP修饰的硝化纤维素膜上，同时两亲性两性霉素B介导的超分子相互作用使其能够插入外泌体的脂质双层中从而实现稳定捕获。电场富集与探针识别相结合的方式显著提升了捕获效率，检测限可达6个外泌体/μL，仅需52μL的样本量，且在简单的芯片结构中9分钟即可完成检测。我们系统优化了电压、频率、流速和样本量等关键操作参数，以最大化富集效果。该平台能够实现对外泌体生物标志物的高灵敏度荧光检测，成功区分了肝癌患者与健康对照组的尿液样本。得益于电场驱动富集与超分子探针识别之间的协同作用，这一方法为尿液外泌体分析提供了一种简单、可靠且快速的方案，显示出其在无创液体活检癌症检测中的应用前景。
引言
肝细胞癌仍是全球范围内重大的健康问题，也是导致癌症相关死亡的主要原因之一（Vogel等人，2022年）。最新的全球癌症统计数据显示，2022年全球约有865,000例新发肝癌病例，其中肝细胞癌占比为75%至85%（Bray等人，2024年）。早期检测在临床上具有重要意义，因为它能提高治愈性干预的机会并提升患者生存率（Singal等人，2022年）。然而，目前针对肝细胞癌早期的监测主要依赖于每半年一次的腹部超声检查结合甲胎蛋白检测，其灵敏度仍有局限（Huang等人，2023年）。因此，迫切需要开发新的技术用于癌症的早期诊断和预后评估。液体活检技术因其无创性及快速的分析能力而日益受到关注，在癌症早期诊断和疾病监测方面展现出巨大潜力（Chan等人，2024年；Lehrich等人，2024年；Ma等人，2024年）。作为液体活检的重要生物标志物来源，外泌体携带着来自其来源细胞的分子信息，能够反映与疾病相关的生理变化（He等人，2018年；Pathan等人，2019年；Yu等人，2022年）。尽管外泌体具有诊断潜力，但其临床应用仍受限于上游分离流程，目前这些流程主要依赖传统的超速离心法以及基于聚合物沉淀的商业试剂盒（Hendrix等人，2023年；B. Li等人，2025年）。这些方法通常耗时较长，需要较大的样本量或专门的仪器，因此难以整合到快速的即时检测流程中（Jia等人，2022年）。微流控技术则非常适合从少量体液样本中提取外泌体用于液体活检，它具有低样本消耗、高分析灵敏度以及快速处理的优势，因此成为早期疾病检测中外泌体富集和分析的理想平台（Ge等人，2025年；Guan等人，2024年；Xie等人，2023年）。
在大多数情况下，微流控技术中外泌体的捕获依赖于固定在通道表面的抗体、适配体或其他亲和探针（Khan和Song，2020年；Service，2008年）。然而，抗体与外泌体表面蛋白的结合依赖于被动扩散作用，而在微通道中的层流状态下，物质传递效率较低，这限制了有效的结合，进而降低了检测灵敏度（Le和Fan，2021年）。为提升捕获性能，人们提出了多种方法，包括在反应腔中填充带有抗体的微球或磁珠，以此打破层流状态，提高富集效率（Li等人，2022年；Shao等人，2015年）。近期的一些芯片平台还将微流控操控与免疫亲和识别相结合，用于外泌体的富集和生物标志物分析。例如，已有研究报道了利用免疫磁珠分离技术并结合抗PD-L1荧光标记的集成微流控EXID系统，以及基于免疫磁泳技术的HER2阳性外泌体分离芯片，用于芯片上的外泌体检测（Lu等人，2022年；Mun等人，2023年）。虽然这些方法增加了接触界面，但通常需要对外珠进行功能化处理，且仍依赖于特定的表面标记物。依赖标记物的捕获方式可能会导致缺乏目标抗原的外泌体亚群丢失，从而造成检测结果的不稳定性及潜在的分析偏差（Havers等人，2023年）。因此，对于尿液外泌体分析而言，将主动的外泌体转运与稳定、不受标记物影响的捕获方式相结合仍然是理想的选择。
我们的实验室最近开发了ADSP探针，可通过疏水作用插入外泌体脂质双层并与其发生多价相互作用，从而高效捕获外泌体，这类探针已在基于阵列的捕获和原位分析中得到成功应用（Feng等人，2025年）。在本研究中，我们进一步将ADSP探针与一种新设计的交流电介电泳辅助微流控平台（acDEP–ADSP芯片）相结合，用于快速灵敏地捕获尿液中的外泌体。在该系统中，梳形电极产生的非均匀电场会引发正介电泳力，将这些力作用于外泌体，使其朝向经过ADSP探针阵列修饰的多孔硝化纤维素膜移动，该膜为外泌体捕获提供了较大的相互作用界面。与此同时，两性霉素B介导的超分子相互作用则增强了外泌体与脂质双层的结合稳定性。通过将电场富集与探针识别相结合，该平台实现了高效的外泌体捕获，且制造过程更为简单，耦合效率较高。这种设计通过结合交流电介电泳增强的转运效应与ADSP探针介导的脂质双层识别机制，克服了基于被动扩散的捕获方式以及依赖标记物富集的缺陷。通过对CD9和OLFM4的定量分析，进一步证明了该平台在肝细胞癌诊断方面的应用潜力，表明其适用于无创液体活检领域。
章节节选
芯片的设计与制备
acDEP–ADSP芯片的设计旨在整合微流控输送、交流电介电泳效应以及ADSP探针介导的特异性识别功能，用于外泌体的捕获。尿液样本被引入含有ADSP修饰硝化纤维素膜的检测腔中。通过向位于检测腔旁边的三叉形梳形电极施加交流电，可产生非均匀电场，借助正介电泳效应与ADSP探针的特异性结合作用，实现高效的外泌体捕获。
该芯片
acDEP-ADSP芯片的工作原理与制备
本研究开发了一种将交流电介电泳技术与ADSP特异性识别功能相结合的外泌体捕获芯片，如图1A所示。简而言之，尿液中的外泌体会在芯片内经过ADSP修饰的硝化纤维素膜上被富集，随后通过抗体介导的荧光标记技术进行检测。该芯片的工作原理如图1B所示：首先通过微流控通道将样本引入反应腔，接着在交叉排列的电极上施加交流电
结论
在本研究中，我们开发了一种基于交流电介电泳辅助的微流控平台，该平台结合了ADSP修饰膜功能，可用于快速富集尿液中的外泌体，并灵敏检测与肝细胞癌相关的生物标志物。在优化条件下，该平台仅需52μL的尿液样本，9分钟即可完成外泌体捕获，整个检测流程耗时100分钟，检测限低至6个外泌体/μL，且重复性良好。临床分析进一步表明，尿液中的OLFM4
CRediT作者贡献说明
吴迪：论文撰写——初稿撰写，研究指导。于文静：论文撰写——初稿撰写，研究指导。杨芳：论文撰写——初稿撰写，研究指导，软件使用，资源准备，项目管理。胡良海：资源准备，项目管理，资金申请。王宝义：论文撰写——初稿撰写，概念构思。张一涵：论文撰写——初稿撰写，数据可视化，方法设计，正式分析，数据整理。周文汉：论文撰写——初稿撰写，数据整理。林逸飞：论文撰写——审稿工作
未引用参考文献
Li等人，2025年；Service, R.F.，2008年。
利益冲突声明
作者声明不存在任何财务或商业利益冲突。
利益冲突声明
? 作者声明自己不存在任何已知的、可能影响本文研究结果的财务利益冲突或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：22374056）以及吉林省科学技术厅（项目编号：20260205025GH）的支持。周文汉与张一涵对本研究做出了同等重要的贡献。
林逸飞|周文汉|张一涵|王宝义|薛瑞宇|于文静|吴迪|胡良海|杨芳
中国吉林长春市130012，吉林大学生命科学学院，超分子结构与材料国家重点实验室，分子酶学与工程教育部重点实验室，超分子化学生物学中心
