《Biosensors and Bioelectronics》：Machine Learning-Assisted Colorimetric Sensor Array Using a Microbially Synthesized Prussian Blue Nanozyme with Enhanced POD-like Activity for Discriminating Sulfur-Containing Metal Salts
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摘要含硫金属盐被广泛用作食品添加剂，但过量残留或在加工过程中发生的化学转化可能会产生更具毒性的物质，从而带来严重的健康风险。然而，现有的含硫金属盐分析方法存在成本高、操作耗时且依赖复杂仪器的问题。在此，我们报道了一种基于纳米酶的比色传感器阵列，该阵列由微生物合成的具有较强过氧化物
摘要
含硫金属盐被广泛用作食品添加剂，但过量残留或在加工过程中发生的化学转化可能会产生更具毒性的物质，从而带来严重的健康风险。然而，现有的含硫金属盐分析方法存在成本高、操作耗时且依赖复杂仪器的问题。在此，我们报道了一种基于纳米酶的比色传感器阵列，该阵列由微生物合成的具有较强过氧化物酶活性的普鲁士蓝纳米酶构成。该阵列将Bio-PB与三种显色底物结合，构建出三通道交叉反应检测平台。当这类物质接触到检测体系时，不同硫氧化态的含硫金属盐会竞争性消耗活性氧，从而产生独特的比色特征。通过机器学习算法（线性判别分析、层次聚类分析和主成分分析)，这些复杂的信号可以被转化为可靠的分类结果。这种基于机器学习的检测方法能够100%准确区分五种含硫金属盐，同时还能正确识别82个未知样本中的98.78%。此外，该传感器还能在10-180微摩尔的浓度范围内实现半定量分析，可区分二元到五元的含硫金属盐混合物，并在牛奶、红葡萄酒和鸡蛋等复杂食品基质中保持良好的检测性能。与传统仅依靠氧化还原反应的纳米酶不同，Bio-PB还能通过静电或疏水作用与细菌膜成分特异性结合，因此在实际样品中具有更高的选择性和稳定性。凭借其简单性、快速性和低成本，再加上机器学习带来的模式识别能力，这种基于Bio-PB的传感器阵列为现场含硫金属盐监测和食品安全检测提供了有力的解决方案。
引言
含硫金属盐，如硫化钠、亚硫酸钠、硫酸钠、焦硫酸钠和过硫酸钠，被广泛用作食品行业的防腐剂和抗氧化剂。然而，过量摄入或长期接触这类物质会对健康造成严重危害。此外，在食品加工和储存过程中，它们还可能发生化学变化，进而带来新的风险。特别是那些含有S2?、S?O?2?和S?O?2?的含硫金属盐，在受热、pH值变化或接触氧气等条件下，可能会发生氧化、还原或歧化反应。例如，毒性较低的亚硫酸根在受热后可能会转化为毒性极高的亚硫酸根离子。因此，准确识别和实时监测含硫金属盐对于保障食品安全和公众健康至关重要。
尽管含硫金属盐的检测技术为食品安全监测带来了希望，但目前仍面临两大挑战。首先，这类物质的化学结构极为相似，因此需要高度灵敏且准确的检测方法。传统的电化学分析方法由于结构相近的离子会产生相互干扰，而且电极的清洁和抛光工作也增加了操作难度。其次，食品基质中的复杂化学环境进一步增加了检测的难度。目前常用的离子色谱法和荧光光谱法虽然灵敏度很高，但由于需要昂贵的仪器、繁琐的样品前处理以及复杂的操作流程，难以在实际应用中推广。因此，亟需开发一种便携、经济且快速的检测方法，用于在复杂基质中检测含硫金属盐。
受哺乳动物嗅觉系统启发的比色传感器阵列因其操作简便、效率高而备受关注，有望成为检测含硫金属盐的有效工具。这类传感器阵列利用多种化学反应产生独特的比色特征，再通过多元统计分析和机器学习技术对这些特征进行解析，从而实现对结构相似但性质不同的分析物的精准区分。纳米酶因其稳定性高、可重复利用性强且催化活性可调控，成为传感器阵列的理想材料。其中，普鲁士蓝纳米酶因其出色的过氧化物酶活性、良好的生物相容性、较强的稳定性以及经过FDA认证的安全性，被视为最理想的传感器成分。不过，传统化学合成法存在环境污染且产率低的问题。因此，通过绿色合成方法制备普鲁士蓝纳米酶，用于构建比色传感器阵列，是解决含硫金属盐检测中便携性和成本问题的有效途径。
为了解决上述问题，我们设计了一种基于纳米酶的传感器阵列，可用于快速、准确地识别五种含硫金属盐。如图1所示，该传感系统的运作原理如下：首先，作为检测元件的生物合成普鲁士蓝纳米酶具有较强的过氧化物酶活性；其次，该传感器阵列将这种纳米酶与显色底物相结合，当纳米酶催化过氧化氢产生活性氧后，这些活性氧会进一步氧化底物，从而产生颜色变化。当含硫金属盐存在时，它们会竞争性消耗活性氧，进而改变底物的氧化状态，形成独特的比色特征；最后，通过简单的过滤、化学反应、吸光度检测以及机器学习分析，该阵列就能够实现对食品样品中含硫金属盐的识别和定量。这种三通道传感器阵列能够100%准确区分五种含硫金属盐，同时还能正确识别82个未知样本中的98.78%。此外，它还能实现对单一含硫金属盐的半定量分析以及混合样品的识别，而且在复杂食品基质中也能保持良好的检测性能。这项研究为检测结构相似但氧化还原性质不同的分析物提供了一种通用方法，同时也为食品样品中含硫金属盐的检测提供了一种绿色、简单、高效且经济的解决方案。
内容节选
材料与方法
本文详细介绍了所用试剂和仪器、Bio-PB的合成方法、其对过氧化物酶活性的评估、其活性动力学的研究、自由基清除实验、含硫金属盐结合前后Bio-PB的ζ电位和FTIR特性分析、该物质的稳定性及批次间一致性、用于含硫金属盐检测的三通道传感器阵列的构建方法、抗干扰测试以及使用该传感器阵列对实际样品的检测过程。
Bio-PB的合成与表征
Bio-PB的合成方法是基于先前已有研究优化而来的，其制备过程如图1a所示。首先，将某种细菌与三氯化铁和六氰合铁(III)酸钾共同培养。当这种细菌将三氯化铁中的铁(III)还原为铁(II)后，生成的铁(II)会与六氰合铁(III)酸钾结合，从而在细菌表面形成普鲁士蓝。在破坏细菌细胞膜后，就能得到蓝色的普鲁士蓝粉末。
结论
综上所述，我们开发了一种基于微生物合成普鲁士蓝纳米酶的比色传感器阵列，该阵列结合了三通道交叉反应检测机制与机器学习算法，无需依赖特定的生物分子识别机制，即可实现高重复性和简易的操作流程。这种方法能够有效处理含硫金属盐带来的细微信号变化。
作者贡献说明
吕岩：实验验证、项目监督。 史兴波：论文撰写与修改、项目监督、资金申请、研究构思。 陈芳：论文初稿撰写、方法设计、实验实施、数据分析、研究构思。 李梦平：实验验证、实验研究、数据整理。 徐新奇：实验资源提供、实验研究。 安晓晓：实验资源提供、实验研究。
未引用参考文献
D'Amore等人，2020年；杨等人。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本研究结果的财务利益冲突或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金、中国国家重点研发计划以及湖南省重点研发计划的资助，特此致谢。
Fang Chen|Mengping Li|Xinqi Xu|Xiaoxiao An|Yan Lv|Xingbo Shi
中国湖南省长沙市410128，湖南农业大学食品科学与技术学院，食品安全微纳生物传感技术实验室，湖南省食品科学与生物技术重点实验室
