TFF2+肝细胞癌细胞与调节性T细胞之间的交互作用驱动肝细胞癌促转移微环境形成和门静脉癌栓

《Cellular Signalling》：Crosstalk between TFF2+ HCC cells and regulatory T cells drives hepatocellular carcinoma prometastatic niche formation and portal vein tumor thrombosis

　　

背景：门静脉癌栓（PVTT）是一个关键事件，促进肝内播散，诱导门静脉高压，并恶化肝细胞癌（HCC）的预后，但其形成机制仍知之甚少。

方法：通过分析来自5例伴有PVTT的HCC患者的15个单细胞RNA测序（scRNA-seq）样本，在肝细胞癌中识别出TFF2⁺HCC细胞。随后通过公共HCC队列的生物信息学分析和实验验证评估了这些细胞的干性和侵袭特征。对15例HCC样本的空间转录组学（ST）分析揭示了TFF2⁺HCC细胞与肿瘤微环境（TME）之间的细胞相互作用，这些发现进一步通过基因共表达分析、细胞共定位分析和免疫组织化学（IHC）得到证实。最后，通过体内基因敲除实验评估了靶向TFF2的转化潜力。

结果：研究人员识别出具有干性特征、高转移潜能和酪氨酸激酶抑制剂（TKI）反应改变的TFF2⁺HCC细胞，这些细胞在HCC和PVTT组织中富集，并与不良预后相关。激活转录因子4（ATF4）被确定为维持TFF2⁺HCC细胞干性和促进上皮间充质转化（EMT）的特异性调节因子。多组学分析揭示，TFF2⁺HCC细胞通过TFF2-C-X-C趋化因子受体4（CXCR4）相互作用将调节性T细胞（Tregs）招募到TME中并激活其免疫抑制功能。这些Tregs反过来通过转化生长因子β1（TGFB1）-TGF-β受体1（TGFBR1）相互作用在TFF2⁺HCC细胞中激活ATF4依赖的促转移信号级联，建立了一个相互促进的肿瘤促进作用环路。体内模型证实，抑制TFF2可抑制Tregs招募并减弱HCC转移。

结论：总之，研究人员的研究强调了TFF2⁺HCC细胞作为伴有PVTT的侵袭性HCC的驱动因素，提出了潜在的治疗靶点和见解。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，晚期诊断和高发的肝内转移，尤其是门静脉癌栓（PVTT），导致患者预后极差。PVTT是HCC最具侵袭性的表现，与不良预后和有限治疗选择密切相关。尽管包括酪氨酸激酶抑制剂（TKI）和免疫检查点抑制剂（ICI）在内的系统治疗取得进展，但晚期HCC患者的总生存改善仍有限，主要归因于患者间治疗反应的高度异质性以及高度动态的肿瘤微环境（TME）。肿瘤进展通常由肿瘤微环境（TME）中多种细胞亚群的复杂相互作用驱动，其中具有干细胞特性的癌症干细胞（CSC）被认为是肿瘤发生、治疗抵抗和转移的关键启动者。然而，在HCC中，许多经典CSC标志物（如EPCAM、PROM1、CD44、SOX9）也在正常肝祖细胞和再生肝细胞中表达，导致靶向这些标志物可能损害肝脏再生，甚至引发肝功能障碍。因此，传统CSC标志物缺乏区分转移驱动肿瘤细胞与正常再生细胞的特异性。此外，从原发肿瘤CSC到已形成PVTT病灶的连续过程中是否存在特定的过渡性细胞状态，以及这些细胞如何重塑局部TME以促进门静脉侵袭和转移定植，仍不清楚。

**研究目的与意义**
为了系统表征驱动HCC进展和PVTT形成的细胞亚群及其在TME中的相互作用，研究人员结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST），绘制了HCC进展的高分辨率时空图谱。研究识别出一种具有侵袭性、过渡性、干细胞样肿瘤细胞亚群——TFF2⁺HCC细胞，并揭示其通过TFF2-CXCR4轴招募调节性T细胞（Tregs），形成正反馈环路驱动PVTT形成。该研究为PVTT形成机制提供了新见解，为开发靶向治疗策略奠定了理论基础，成果发表在《Cellular Signalling》。

**主要技术方法**
研究人员收集了来自广东药科大学第一附属医院的5例伴有PVTT的HCC患者的配对样本（癌旁组织、原发肿瘤、PVTT），进行scRNA-seq分析。利用公共HCC队列（包括TCGA-LIHC、ICGC-LIRI-JP及多个GEO数据集）进行生物信息学验证。通过ST分析15例HCC样本，结合基因共表达分析、细胞共定位分析和免疫组织化学（IHC）及多重免疫荧光（mIF）验证细胞间相互作用。体内功能评估采用C57BL/6J小鼠脾内注射Hepa1-6细胞建立肝转移模型，通过基因敲除实验评估TFF2抑制效果。

**研究结果**

**3.1 伴有PVTT的HCC的单细胞转录组动态景观**
通过scRNA-seq分析15个配对样本，共获得53,039个高质量细胞，经无监督聚类识别出8种主要细胞类型（T细胞、NK细胞、髓系细胞、上皮细胞、增殖细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞）。随着疾病进展，免疫细胞比例逐渐降低，而上皮细胞和基质细胞比例增加，符合转移性肿瘤TME更复杂的特征。

**3.2 TFF2⁺HCC细胞源自CSC并表现出干性和EMT激活**
上皮细胞重聚类后得到6个亚群（NM及M0-M4）。M0（CSC）和M3（TFF2⁺HCC细胞）具有高拷贝数变异（CNV）评分，伪时间轨迹分析显示M0位于早期，M3为过渡性亚群。TFF2⁺HCC细胞高表达干性标志物（ALDH1A1、CD24、SOX9等）并激活EMT程序。免疫荧光证实其在HCC组织中存在，ST分析显示其在T4期HCC（伴PVTT）中富集。功能实验表明，TFF2敲低可减少MHCC97H和Hepa1-6细胞的球体形成、迁移能力，并上调E-cadherin、下调N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白表达。

**3.3 高TFF2⁺HCC细胞负荷与不良预后和TKI反应特征相关**
通过BayesPrism在多个公共HCC队列中反卷积TFF2⁺HCC细胞丰度，发现其在HCC组织中显著高于癌旁，且随BCLC分期和AJCC分期进展而增加，尤其在有PVTT的样本中更高。生存分析显示高TFF2⁺HCC细胞浸润与总生存降低显著相关。BeyondCell和OncoPredict预测该亚群对索拉非尼和仑伐替尼敏感性降低，TFF2敲低可降低MHCC97H细胞的IC50值。

**3.4 转录因子ATF4调控TFF2⁺HCC细胞维持干性和促进转移**
通过SCENIC和DoRothEA分析，在TFF2⁺HCC细胞中ATF4转录活性最高。在TCGA-LIHC和GSE36376队列中，ATF4在HCC中高表达且与不良预后相关。双荧光素酶实验证实ATF4直接结合TFF2启动子区域并促进其转录。ATF4或TFF2单独或联合敲低均可减少TFF2分泌、球体形成和迁移能力。

**3.5 TFF2⁺HCC细胞与免疫细胞的细胞间相互作用**
CellChat分析显示TFF2⁺HCC细胞与免疫细胞（特别是Treg、Macro_CCL18、Macro_MKI67）的相互作用强度高于CSC。TFF2敲低导致MHCC97H细胞分泌的多种趋化因子（CXCL10、CXCL11、CXCL8）和免疫抑制因子（TGF-β1、IL-10）减少。ST分析证实TFF2⁺HCC细胞富集区域存在大量免疫细胞，包括T细胞。

**3.6 TFF2⁺HCC细胞通过TFF2-CXCR4招募和激活Treg驱动PVTT形成**
在Treg中，TFF2-CXCR4配体-受体对表现出高通信概率和特异性。IHC和多重免疫荧光显示HCC组织中TFF2表达与Treg比例（FOXP3⁺）正相关。Transwell趋化实验证实TFF2直接促进Treg迁移。NicheNet分析预测Treg通过TGFB1-TGFBR1轴激活TFF2⁺HCC细胞中的ATF4，Western blot证实TGF-β以剂量依赖方式上调ATF4和TFF2蛋白表达，且ATF4沉默可阻断此效应。ST中SpaGene分析显示TFF2-CXCR4和TGFB1-TGFBR1相互作用空间重叠。

**3.7 靶向抑制TFF2破坏Treg招募并抑制体内HCC转移**
在C57BL/6J小鼠肝转移模型中，Tff2敲低组肝荧光信号强度、转移灶数量和大小均显著低于对照组，H&E染色显示转移灶减少，流式细胞术检测显示肿瘤组织中CD25⁺FOXP3⁺ Treg比例降低。

**讨论与结论**
讨论部分指出，PVTT是HCC侵袭性的标志，传统CSC标志物的局限性促使本研究识别出TFF2⁺HCC细胞作为新型驱动亚群。该亚群通过TFF2-CXCR4轴招募Tregs，Tregs通过TGFB1-TGFBR1激活ATF4，形成正反馈环路促进转移。研究局限性包括：TKI敏感性预测仅基于体外验证，Hepa1-6模型不能完全模拟人HCC免疫微环境，未系统探索其他转录因子（如HIF1α、c-Myc）的协同作用，缺乏肿瘤细胞特异性基因敲除的因果证据，以及ATF4上游激活机制尚待阐明。

结论：总之，本研究描绘了伴有PVTT的HCC的时空异质性景观，并识别出一个新的肿瘤干性亚群——TFF2⁺HCC细胞。这些细胞与Treg之间的反馈环路是HCC侵袭和转移导致PVTT形成的核心驱动因素。研究结果为伴有PVTT的HCC的肿瘤异质性提供了先前未知的见解，并确定了阻断PVTT进展和改善晚期HCC患者临床结局的潜在治疗靶点。