ZL006-05通过抑制中性粒细胞髓过氧化物酶相关通路，防止卒中后tPA引发的出血性转化

《Stroke and Vascular Neurology》：ZL006-05 prevents tPA-induced haemorrhagic transformation after stroke via inhibiting neutrophil myeloperoxidase-related pathway

　　摘要
背景：出血性转化是急性缺血性卒中患者接受溶栓治疗时最令人担忧的并发症。本研究旨在探讨一种名为bornyl-2-hydroxy-4-(2-hydroxy-3,5-dichlorobenzyl) aminobenzoate（ZL006-05）的神经保护剂是否可通过抑制中性粒细胞髓过氧化物酶活性，预防短暂性大脑中动脉闭塞小鼠中重组组织型纤溶酶原激活剂引发的出血性转化。

方法：在成年小鼠中诱导短暂性大脑中动脉闭塞模型。根据110分钟和5小时的大脑中动脉闭塞模型，模拟临床治疗窗口内及之外的溶栓再通情况。在给予重组组织型纤溶酶原激活剂之前或之后注射ZL006-05。通过分光光度法检测脑组织中的血红蛋白和Evans蓝含量，利用髓过氧化物酶氧化活性测定试剂盒检测MPO活性，通过流式细胞术或免疫荧光法观察中性粒细胞的迁移与浸润情况，用Hoechst染色的DNA定量中性粒细胞外陷阱的形成。此外，使用抗Ly6G单克隆抗体1A8清除中性粒细胞，通过西方印迹法检测促炎细胞因子的表达及MPO活性。

结果：ZL006-05能够预防110分钟大脑中动脉闭塞小鼠中重组组织型纤溶酶原激活剂引发的出血性转化及血脑屏障损伤，同时降低5小时大脑中动脉闭塞小鼠因该药物导致的死亡率。该物质可通过抑制重组组织型纤溶酶原激活剂与高迁移率群蛋白B1共同作用所引发的中性粒细胞MPO活化，从而防止缺血脑组织中的MPO活化。分子对接分析表明ZL006-05是一种MPO抑制剂，且在纯化的MPO蛋白及培养的炎症细胞中呈剂量依赖性地抑制其酶活性。在MPO缺乏的小鼠中，重组组织型纤溶酶原激活剂引发的出血性转化显著减轻。此外，ZL006-05还能逆转重组组织型纤溶酶原激活剂诱导的中性粒细胞迁移、浸润及中性粒细胞外陷阱的形成。值得注意的是，在MPO基因敲除或中性粒细胞被清除的小鼠中，ZL006-05的抑制作用消失。另外，该物质仅能抑制野生型中性粒细胞中的促炎细胞因子表达，而对MPO缺乏型中性粒细胞无此效果。

结论：ZL006-05可通过干扰中性粒细胞MPO的活化，预防重组组织型纤溶酶原激活剂引发的血脑屏障破坏及出血性转化。

相关已有研究：症状性颅内出血是静脉溶栓治疗中最令人担忧的并发症。Bornyl-2-hydroxy-4-(2-hydroxy-3,5-dichlorobenzyl) aminobenzoate已证实可减轻缺血/再灌注损伤，促进实验性卒中模型中的功能恢复，并在临床试验中展现出优异的功能改善效果。

本研究贡献：本研究表明，ZL006-05可通过抑制中性粒细胞及缺血脑组织中的髓过氧化物酶活化，预防重组组织型纤溶酶原激活剂引发的出血性转化及血脑屏障损伤。

对研究、实践或政策的潜在影响：ZL006-05有望在临床实践中优化溶栓治疗方案。

引言：尽管机械取栓技术有所发展，但对于符合适应症的患者而言，静脉溶栓仍是急性缺血性卒中最常用的治疗方法。症状性颅内出血是溶栓治疗中最令人担忧的并发症，它会导致梗死范围扩大并增加死亡率，这也是重组组织型纤溶酶原激活剂静脉溶栓治疗在急性缺血性卒中患者应用中的主要限制。最新研究显示，阿替普酶与经过基因改造的tenecteplase引发症状性颅内出血的风险相似。因此，溶栓治疗引发的出血性转化依然是急性缺血性卒中治疗面临的挑战之一。血脑屏障的破坏是重组组织型纤溶酶原激活剂引发出血性转化的关键环节。急性缺血性卒中发生后，中性粒细胞数量显著增加，同时髓过氧化物酶活性也大幅上升，这种酶能够将过氧化氢和氯离子转化为次氯酸，进而对脑组织再灌注损伤起到重要作用。此外，次氯酸还会促使二硫键结合的高迁移率群盒1蛋白释放，这类危险相关分子模式会引发脑部炎症，进一步导致血脑屏障受损。因此，抑制中性粒细胞髓过氧化物酶的活性或许能够避免再灌注治疗引发的血脑屏障破坏及出血性转化。有研究指出，一种名为(5-(3,5-dichloro-2-hydroxy benzylamino)-2-hydroxybenzoic acid)（ZL006）的小分子物质能够抑制体外人类胚胎肾293T细胞中的MPO活性。ZL006的类似物——bornyl-2-hydroxy-4-(2-hydroxy-3,5-dichlorobenzyl) aminobenzoate（ZL006-05），可在实验性卒中模型中减轻缺血/再灌注损伤并促进功能恢复。极低剂量的ZL006-05经颅内注射在恶性大脑中动脉梗死患者中具有可行性、安全性且疗效良好。一项多中心、随机、双盲、安慰剂对照的II期临床试验表明，静脉注射ZL006-05（每次40毫克）耐受性良好，其功能改善效果显著优于安慰剂组。目前，针对急性缺血性卒中的ZL006-05 III期临床试验已经结束，正在等待在中国上市审批。在本研究中，我们探讨了ZL006-05是否可通过抑制中性粒细胞髓过氧化物酶活性，预防卒中模型中重组组织型纤溶酶原激活剂引发的出血性转化及血脑屏障破坏。

材料与方法：
动物：本研究使用了成年C57BL/6小鼠以及MPO缺乏型小鼠。所有动物实验均按照机构动物护理与使用委员会批准的方案（IACUC-1812012）进行，并遵循《动物研究：体内实验报告指南》2.0版本的要求。详细内容见在线补充材料。
卒中模型、纳入与排除标准、梗死面积及生存曲线测定：采用先前描述的方法诱导短暂性大脑中动脉闭塞模型。根据预先设定的纳入与排除标准，将动物分组并纳入最终统计分析。脑梗死面积通过2,3,5-三苯基四唑氯化物染色法测定。组间生存曲线的比较采用Log-rank检验，具体方法已在先前文献中详细阐述。各组动物分组前的基线神经功能评分见在线补充表S1。样本量、干预后因死亡而被排除的动物数量以及终点评估时的动物数量等信息见在线补充表S2，详细内容均在在线补充材料中给出。
药物与给药方式：本研究使用了ZL006-05（Y-3）注射液及重组组织型纤溶酶原激活剂。ZL006-05的剂量为4毫克/千克，这一剂量是根据先前研究确定的。详细信息见在线补充材料。
出血性转化、脑血流及Evans蓝染料外渗程度的检测：通过分光光度法测定脑组织中的血红蛋白含量及Evans蓝染料外渗程度。脑组织出血程度则按照先前描述的方法进行组织学评分。脑血流则通过激光散斑对比成像系统测定，详细内容见在线补充材料。
细胞培养与处理：细胞培养遵循先前描述的方案进行。中性粒细胞的分离同样依据先前方法稍作修改后实施。中性粒细胞外陷阱的形成程度也按先前方法测定。中性粒细胞的清除则使用抗Ly6G单克隆抗体1A8，操作方式与先前描述一致。外周血中中性粒细胞CD11b及Ly6G蛋白的表达通过流式细胞术检测，具体方法略有调整。详细内容见在线补充材料。
活性氧及MPO活性的测定：培养的原代中性粒细胞中的活性氧生成量通过2’, 7’–二氯荧光素活性氧测定试剂盒检测。细胞或组织中的MPO活性则利用髓过氧化物酶氧化活性测定试剂盒测定，详细信息见在线补充材料。
免疫组化与西方印迹分析：免疫组化及西方印迹分析均按照既定方法进行。

关键资源：抗体、重要商业检测试剂、化学及生化试剂、实验材料以及软件和算法的详细信息见在线补充表S3。

统计学分析：数据采用GraphPad Prism 6.0软件进行分析，结果以均值±标准差表示。显著性阈值设定为p值小于0.05。符合纳入标准的动物被随机分配到不同实验组。样本量是通过“样本量（功效分析与样本大小计算）”软件，以α=0.05的显著性水平及90%的统计功效来估算的。所有实验均在盲态条件下进行，详细内容见在线补充材料。

结果：
ZL006-05预处理可预防重组组织型纤溶酶原激活剂引发的出血性转化及血脑屏障破坏：实验方案如图1A所示。重组组织型纤溶酶原激活剂的剂量是根据先前研究确定的。110分钟的大脑中动脉闭塞模型（模拟治疗窗口内的再通情况）会导致同侧脑组织出现明显的Evans蓝染料泄漏，同时Zonula occludens-1及occludin蛋白的表达水平下降，这些变化均表明存在血脑屏障损伤。与单纯缺血/再灌注模型相比，重组组织型纤溶酶原激活剂会造成更严重的血脑屏障损伤。ZL006-05不仅能够减轻缺血/再灌注模型引起的Evans蓝染料泄漏以及Zonula occludens-1和occludin蛋白表达下降的情况，还能阻止重组组织型纤溶酶原激活剂导致的血脑屏障损伤进一步恶化（图1B–F）。此外，重组组织型纤溶酶原激活剂会显著增加缺血/再灌注模型中同侧脑组织的血红蛋白含量，而ZL006-05预处理可消除重组组织型纤溶酶原激活剂的这种有害作用（图1G,H）。我们还在雌性小鼠中检测了ZL006-05对重组组织型纤溶酶原激活剂引发的出血性转化及血脑屏障破坏的影响，结果与雄性小鼠相似（见在线补充图S1）。总体而言，只要在临床治疗窗口内使用，ZL006-05即可预防重组组织型纤溶酶原激活剂引发的血脑屏障破坏及出血性转化。

为探究ZL006-05是否能在重组组织型纤溶酶原激活剂的最佳治疗窗口之外预防此类损伤，我们让小鼠接受了更接近人类恶性大脑中动脉梗死的5小时大脑中动脉闭塞模型。实验方案如图2A所示。激光散斑对比成像结果显示，血管支架取出后2小时，脑血流就已恢复（图2B,C）。再灌注48小时后，对照组和重组组织型纤溶酶原激活剂组的死亡率分别超过60%和80%。在重组组织型纤溶酶原激活剂组中，超过70%的动物在给药后3小时内死亡。而在再灌注前20分钟给予ZL006-05预处理后，动物的累积生存率明显高于对照组和仅接受重组组织型纤溶酶原激活剂组，且其终点死亡率也显著低于重组组织型纤溶酶原激活剂组（图2D,E）。此外，重组组织型纤溶酶原激活剂与ZL006-05联合使用后，脑梗死体积较对照组显著缩小（图2F）。由于重组组织型纤溶酶原激活剂组存活的动物数量较少，无法在终点时检测血红蛋白和Evans蓝的含量。因此，我们在重组组织型纤溶酶原激活剂给药后2小时，观察了ZL006-05是否能预防5小时大脑中动脉闭塞小鼠的出血性转化。给药后2小时内，重组组织型纤溶酶原激活剂组的5只小鼠中有4只死亡，且均出现大血管出血及脑实质出血现象；而重组组织型纤溶酶原激活剂+ZL006-05组的动物均未死亡，也没有明显的大血管出血，其出血评分也显著降低（图2G,H）。另外，ZL006-05还能显著降低持续48小时的大脑中动脉永久性闭塞小鼠的死亡率和脑梗死体积（见在线补充图S2）。由于5小时大脑中动脉闭塞模型的动物死亡率远高于大脑中动脉永久性闭塞模型的动物，尤其是在卒中后12小时内（图2D与在线补充图S2A对比），因此对于恶性卒中而言，延迟再灌注可能会带来不良后果。

延迟使用ZL006-05可逆转重组组织型纤溶酶原激活剂引发的出血性转化及血脑屏障破坏：为探究延迟使用ZL006-05是否能够减轻重组组织型纤溶酶原激活剂引发的出血性转化，我们在重组组织型纤溶酶原激活剂给药后再给予ZL006-05（图3A）。重组组织型纤溶酶原激活剂会进一步加重缺血/再灌注模型中同侧脑组织中Evans蓝含量的升高以及Zonula occludens-1和occludin蛋白表达水平的下降；而ZL006-05则可以逆转重组组织型纤溶酶原激活剂的这些作用（图3B–F）。此外，重组组织型纤溶酶原激活剂与ZL006-05联合使用后，缺血/再灌注模型中Evans蓝含量的升高幅度显著减小（图3C），这表明ZL006-05具有保护血脑屏障的作用。重组组织型纤溶酶原激活剂还会加重缺血/再灌注模型中同侧脑组织血红蛋白含量的升高，ZL006-05则能消除重组组织型纤溶酶原激活剂的这种有害作用（图3G,H）。为了直观观察出血性转化的程度，我们测定了同侧脑半球的整体出血评分。与血红蛋白含量类似，接受重组组织型纤溶酶原激活剂治疗的小鼠的出血评分约为未接受该药物小鼠的3倍，而ZL006-05则完全消除了重组组织型纤溶酶原激活剂的这种影响（见在线补充图S3）。此外，延迟使用ZL006-05还能显著降低缺血/再灌注模型中同侧脑半球血红蛋白含量的升高幅度（见在线补充图S4A–C）。这些研究结果表明，ZL006-05既能预防缺血/再灌注模型引发的出血性转化，也能预防重组组织型纤溶酶原激活剂引发的出血性转化。而且，在重组组织型纤溶酶原激活剂给药后使用ZL006-05，还可逆转该药物引起的脑梗死体积增大现象（图3I, J）。接下来，我们分析了动物的神经功能评分及生存率（图3K）。与仅接受重组组织型纤溶酶原激活剂治疗的小鼠相比，ZL006-05预处理并在其后继续给予重组组织型纤溶酶原激活剂的小鼠，在卒中后5天的神经功能评分显著更低。虽然这两组小鼠的神经功能评分均有下降趋势，但差异无统计学意义（图3L）。卒中后8天时，ZL006-05预处理并在其后继续给予重组组织型纤溶酶原激活剂的小鼠，其生存率显著高于仅接受重组组织型纤溶酶原激活剂治疗的小鼠，而且其累积生存曲线也明显优于仅接受溶剂处理的小鼠（图3M）。

ZL006-05可预防重组组织型纤溶酶原激活剂引发的MPO活化：中性粒细胞的迁移是重组组织型纤溶酶原激活剂引发出血性转化的机制之一。中性粒细胞产生的MPO是形成中性粒细胞外陷阱所必需的。为验证重组组织型纤溶酶原激活剂是否会激活中性粒细胞中的MPO，我们将原代中性粒细胞与重组组织型纤溶酶原激活剂一起培养，培养过程中加入2%的假手术组或110分钟大脑中动脉闭塞组小鼠的血清，培养时间为2小时。rtPA与来自tMCAO小鼠的2%血清联合使用，而并非来自假手术小鼠的血清，能显著提升中性粒细胞MPO活性（图4A），这表明“缺血血清”是rtPA引发MPO活化的必要条件。ZL006-05可呈剂量依赖性地抑制rtPA与“缺血血清”共同作用所引发的MPO活化（图4B）。HMGB1与rtPA诱导的HT有关。8 25 我们检测了tMCAO后小鼠外周血中的HMGB1水平（图4C），发现缺血/再灌注会显著升高HMGB1水平，rtPA则会进一步加剧缺血/再灌注对HMGB1水平的提升，而ZL006-05可阻止rtPA促使HMGB1生成的增加（图4D）。随后，我们在含有1?μg/mL HMGB1的条件下，用rtPA处理培养的中性粒细胞2小时。rtPA与HMGB1共同作用会显著提升培养中性粒细胞的MPO活性，这说明升高的HMGB1可能是“缺血血清”与rtPA协同诱导MPO活化的原因。ZL006-05可呈剂量依赖性地抑制rtPA+HMGB1共同作用引发的MPO活化（图4E）。接着，我们检测了tMCAO后24小时同侧大脑中的MPO活性（图4C）。预先使用ZL006-05不仅能抑制缺血/再灌注引起的MPO活性上升，还能避免rtPA进一步加剧缺血/再灌注导致的MPO活性升高（图4F）。与预先处理类似，rtPA处理后再使用ZL006-05也能阻断rtPA对MPO的影响（图4G,H）。此外，再灌注后使用ZL006-05也能降低缺血/再灌注引起的MPO活性上升（在线补充图S4A、D）。这些结果表明ZL006-05能够抑制缺血脑组织中由缺血/再灌注或rtPA引发的MPO活化。重要的是，与野生型小鼠相比，MPO基因敲除小鼠的rtPA诱导的HT显著减轻，且延迟使用ZL006-05也不会影响MPO?/?小鼠的rtPA诱导的HT（图4I），这说明ZL006-05是通过干扰MPO活化来预防rtPA诱导的HT的。另外，使用四肽抑制剂P5779阻断HMGB1与Toll样受体4（TLR4）的相互作用后，HMGB1+rtPA对中性粒细胞中MPO活化的促进作用也被消除（图4F），这表明TLR4信号通路参与了HMGB1+rtPA诱导的MPO活化。活化的MPO会产生ROS。27 我们发现ZL006-05可呈浓度依赖性地抑制佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）诱导的中性粒细胞ROS生成（在线补充图S5）。此外，rtPA会加剧缺血/再灌注导致的MPO蛋白水平上升，而在rtPA处理前后使用ZL006-05都能阻断rtPA对MPO表达的影响（在线补充图S6）。ZL006-05可抑制MPO蛋白以及培养的炎症细胞中的MPO酶活性。为确定ZL006-05是否直接抑制MPO酶活性，我们将ZL006-05与MPO的活性位点结合（蛋白质数据库编号：4c1m）。28 ZL006-05中的3,5-二氯-2-羟基苄胺部分与MPO的血红素口袋入口处结合，2-降冰片醇部分朝向MPO表面延伸，而3,5-二氯-2-羟基苄胺的苯环则几乎与血红素的吡咯环平行，使得血红素的苯环与吡咯环之间形成较强的π?π相互作用。此外，羟基上的氧原子位置恰好可以与Asp239的羧基形成氢键。氯原子则能与Gln91的侧链形成较弱的氢键。中间苯环上的羟基还会与血红素的羧酸根形成氢键。两个苯环之间的连接键上的-NH-则可以与Glu102的羧酸根以及血红素的羧酸根形成三个盐桥。2-降冰片醇部分则占据了由Phe366和Phe407在活性位点入口处形成的疏水口袋。通过对接复合物的结合关系推测，ZL006-05可能是MPO的可逆抑制剂（图5A）。接下来，我们检测了ZL006-05是否会影响纯化后的MPO蛋白的酶活性，结果发现ZL006-05可呈浓度依赖性地抑制MPO活性（图5B、C）。MPO的活性可能会因其在细胞内与其他分子结合而发生变化。29 因此，我们在用PMA处理0.5小时的培养原始中性粒细胞，以及用脂多糖（LPS）处理18小时的BV2小胶质细胞和Ana-1巨噬细胞中检测了MPO的酶活性。ZL006-05同样可呈浓度依赖性地抑制MPO酶活性，且其抑制效果比在纯化MPO蛋白中更为显著（图5D–F）。尤其是在中性粒细胞和BV2细胞中，低至10?nM的浓度就能显著抑制MPO活性（图5D,E）。ZL006-05可防止rtPA诱导的中性粒细胞动员、募集以及NETs的形成。我们对经过110分钟tMCAO处理的小鼠同时给予rtPA和ZL006-05处理，然后通过流式细胞术分析了外周白细胞中中性粒细胞的比例（图6A）。缺血/再灌注会显著增强中性粒细胞的动员，rtPA则会进一步加剧这种动员效应，而预先使用ZL006-05则能显著降低缺血/再灌注导致的中性粒细胞动员，并阻止rtPA进一步加重这种动员现象（图6B,C）。此外，无论是110分钟还是300分钟的tMCAO处理，都会导致大量中性粒细胞聚集到缺血脑组织中，尤其是300分钟tMCAO处理时更为明显。在最佳治疗窗口内或之外使用rtPA都会加剧缺血/再灌注导致的中性粒细胞向缺血脑组织的募集，而预先使用ZL006-05则能避免rtPA带来的这种中性粒细胞募集加剧现象（在线补充图S7）。总体而言，ZL006-05能够阻止在最佳治疗窗口内或之外，由缺血/再灌注及rtPA引发的中性粒细胞动员和募集现象。为确定ZL006-05是否能够阻止rtPA诱导的NETs形成，我们让中性粒细胞与rtPA共同孵育8小时以诱导NETs形成。正如预期，rtPA会显著促进NETs的形成，而ZL006-05则能显著减少rtPA诱导的NETs数量（图6D）。接着，我们研究了ZL006-05是否能在缺血脑组织中阻止rtPA诱导的NETs形成。实验所用的tMCAO模型和处理方法与图6A一致。缺血/再灌注会显著增加同侧脑组织中Ly6G+/H3cit+细胞的数量，这表明存在NETs形成。rtPA会使缺血/再灌注导致的Ly6G+/H3cit+细胞数量增加约两倍，而ZL006-05则能阻止rtPA对这类细胞的影响（图6E）。综上，ZL006-05既能在体外培养的中性粒细胞中，也能在缺血脑组织中，阻止rtPA诱导的NETs形成。为确定ZL006-05是否通过靶向中性粒细胞来预防rtPA诱导的HT，我们在tMCAO处理前的72小时、48小时、24小时以及0小时分别给小鼠注射抗Ly6G抗体，以清除中性粒细胞（图6F）。这种处理几乎完全清除了外周血液中的中性粒细胞（图6G）。在中性粒细胞被清除后，rtPA组与ZL006?05+rtPA组的缺血脑组织中的血红蛋白水平没有显著差异（p>0.05），这说明ZL006-05是通过靶向中性粒细胞来预防rtPA诱导的HT的。ZL006-05可抑制神经炎症。为确定ZL006-05是否能抑制促炎细胞因子的表达，我们让培养的原始中性粒细胞与LPS/干扰素-γ（IFN-γ）共同孵育3小时，以激发炎症反应。预先使用ZL006-05可显著降低白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达水平（图7A–C）。此外，我们还将MPO?/?小鼠和野生型小鼠的中性粒细胞与LPS/IFN-γ共同孵育3小时，结果发现ZL006-05只能抑制MPO+/+中性粒细胞中的IL-1β表达，而对MPO?/?中性粒细胞则无此作用（图7D）。接着，我们对经过110分钟tMCAO处理的小鼠，在tMCAO处理后12小时立即静脉注射4mg/kg的ZL006-05，然后在tMCAO处理后24小时检测了同侧脑组织中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-1β和TNF-ɑ的水平（图7E）。110分钟的tMCAO处理会导致大量iNOS、IL-1β和TNF-ɑ的表达，而ZL006-05则完全逆转了tMCAO引发的这些促炎因子的表达（图7F–I）。总体而言，ZL006-05是通过干扰MPO活化来抑制缺血/再灌注引发的神经炎症的。讨论HT是急性缺血性卒中患者接受溶栓治疗时最令人担忧的并发症。1 2 我们的研究显示，无论在临床治疗窗口内还是之外使用rtPA，ZL006-05都能预防其引发的HT。ZL006-05能够阻止或逆转rtPA在中性粒细胞及缺血/再灌注脑组织中引发的MPO活化，同时还能阻止rtPA诱导的中性粒细胞动员、募集以及NETs的形成。此外，ZL006-05还能抑制纯化后的MPO蛋白以及培养的炎症细胞中的MPO酶活性。重要的是，如果敲除MPO或清除血液中的中性粒细胞，ZL006-05对rtPA诱导的HT的抑制效果就会消失。因此，ZL006-05很可能是通过抑制中性粒细胞的MPO活化来预防rtPA诱导的HT的。中性粒细胞的活化与脱颗粒是MPO生成的重要机制，也是血浆中MPO的来源。30 MPO会生成HOCl及其他氯化物质，进而引发炎症和氧化应激，而这些因素又是NETs形成的必要条件。7 24 31 急性缺血性卒中发生后，中性粒细胞数量显著增加，同时MPO的生成量也会大幅上升。7 8 再灌注处理还会进一步加剧MPO的活化。32 我们发现，rtPA诱导中性粒细胞MPO活化需要HMGB1的协同作用，HMGB1是一种在血清中大量产生并积累的DAMP分子，与卒中后rtPA诱导的HT有关。25 HMGB1可通过TLR4信号通路引发炎症反应，26 而这一通路与中性粒细胞MPO活化以及rtPA诱导的HT密切相关。33 34 我们发现，阻断HMGB1与TLR4的相互作用就能减弱HMGB1+rtPA对MPO的活化作用。因此，HMGB1-TLR4信号通路很可能参与了rtPA诱导的MPO活化过程。活化的中性粒细胞MPO会产生ROS，7 8 31 而中性粒细胞内的ROS又会促使MPO释放以及NETs形成。27 35 ROS不仅对HMGB1从细胞核中释放至关重要，还决定了细胞外HMGB1的生物活性，因为ROS能够促使HMGB1形成分子内的二硫键，而这种结构变化有助于促进中性粒细胞活化及NETs形成。8 36 rtPA可直接或间接生成大量ROS。37 因此，ROS-HMGB1-MPO-ROS循环可能参与了rtPA诱导的HT过程。在本研究中，ZL006-05不仅直接抑制了MPO的活化，还抑制了活化中性粒细胞中的ROS生成。因此，ZL006-05很可能能够打破ROS-HMGB1-MPO-ROS循环，从而预防rtPA诱导的HT。中性粒细胞的募集、活化以及NETs形成是tPA诱导的脑血屏障损伤和HT在缺血脑组织中产生的机制基础。15 23 38 我们发现，ZL006-05能够阻止rtPA诱导的中性粒细胞向缺血脑组织中的动员、募集以及NETs的形成。更重要的是，清除中性粒细胞后，ZL006-05对rtPA诱导的HT的抑制效果就会消失，这说明ZL006-05很可能是通过靶向中性粒细胞来预防rtPA诱导的HT的。酶促性的MPO/HOCl系统与基质金属蛋白酶2/9（MMP2/9）的表达和活性有关，39 40 这两种酶在卒中后脑血屏障破坏过程中起着关键作用。6 此外，rtPA还会增强MMP2/9对脑血屏障的促炎作用。6 因此，我们不能排除ZL006-05也可能通过影响MMP2/9来抑制rtPA诱导的脑血屏障损伤的可能性。另外，rtPA还能通过调节N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）来引发神经毒性。22 41 中性粒细胞表面表达有NMDARs，42 而ZL006-05能够阻断NMDAR的下游信号传导，进而阻止PSD-95与nNOS之间的相互作用。9 11 然而，由于中性粒细胞中不存在PSD-95与nNOS的相互作用，ZL006-05无法通过阻断这一相互作用来阻止rtPA诱导的中性粒细胞MPO活化。ZL006-05是含α2结构的γ-氨基丁酸A型受体（GABAAR）的正变构调节剂。11 由于中性粒细胞中缺乏功能性的GABAARs，43 ZL006-05也无法通过激活GABAAR来阻止rtPA诱导的中性粒细胞MPO活化。此外，我们还发现，5小时tMCAO处理导致的中性粒细胞向脑组织的募集程度远高于110分钟tMCAO处理的情况，这或许可以解释为何在临床治疗窗口之外使用rtPA会导致大多数动物死亡。除了中性粒细胞外，巨噬细胞和小胶质细胞中也表达有MPO。31 在本研究中，tMCAO处理后24小时测得的脑组织中MPO水平显著升高，这类MPO很可能主要来自中性粒细胞，因为中性粒细胞中的MPO活性在卒中发生后的1–3天达到峰值，而巨噬细胞/小胶质细胞中的MPO活性则在卒中发生后的5–7天达到峰值。44 此外，清除中性粒细胞后，ZL006-05对rtPA诱导的HT的保护作用也会消失（图6H）。因此，在tMCAO处理后24小时，与HT相关的脑组织中MPO活性升高很可能主要来自中性粒细胞。当然，我们也不能排除脑组织中MPO活性升高部分是由于MPO基因表达上调所致，因为rtPA会加剧缺血/再灌注导致的MPO蛋白水平上升（在线补充图S6）。局限性在本研究中，我们采用了tMCAO模型而非栓塞性大脑中动脉闭塞模型来研究ZL006-05对rtPA诱导的HT的保护作用。虽然tMCAO模型能避免干扰与rtPA溶栓相关的血液学变化，但它与栓塞性大脑中动脉闭塞模型在炎症反应方面可能存在显著差异。此外，我们的研究仅在一个实验中探讨了ZL006-05对雌性小鼠中rtPA诱导的HT的影响，未来研究有必要系统评估不同性别小鼠在使用ZL006-05时的差异。此外，通过分子对接预测的ZL006-05与MPO活性位点之间的相互作用，仍需未来通过对蛋白质与药物分子共晶体的冷冻电子显微镜分析来从结构层面加以确认。另外，本研究通过检测埃文斯蓝外渗情况以及紧密连接蛋白的表达来评估血脑屏障功能，但要想阐明其背后的机制，仍需要采用更直接或更高分辨率的检测方法，比如双光子显微镜或透射电子显微镜分析，以及检测紧密连接蛋白与内皮标志物的共定位情况。

结论：rtPA通过HMGB1-TLR4通路激活中性粒细胞中的MPO，进而引发中性粒细胞的动员、浸润以及NET的形成，最终导致血脑屏障损伤并诱发高血压。ZL006-05则通过干扰中性粒细胞MPO的激活来阻止tPA引发的高血压。

贡献者：WC：负责初稿撰写、方法设计、实验研究、正式分析、数据整理以及概念构建；HW：负责方法设计、实验研究、数据整理、结果验证、研究监督以及概念构建；XX：负责方法设计、正式分析以及数据整理；Y-JQ：负责方法设计及实验研究；LZ：负责初稿撰写及方法设计；DZ：负责文章审阅与编辑、结果验证、研究监督、资金申请以及概念构建，同时为该研究的担保人。

资金支持：本研究得到了中国国家自然科学基金（82090042）、中国国家重点研发计划（2021YFA1101803）以及中国STI2030重大专项（2022ZD0211703）的资助。

利益冲突：无。

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