线粒体自噬与细胞质mtDNA诱导的炎症的双重调控在炎症性骨丢失治疗中的应用

《Free Radical Biology and Medicine》：Dual-regulation of mitophagy and cytosolic mtDNA-induced inflammation for the treatment of inflammatory bone loss

　　

摘要

炎症性骨质疏松症，也被称为“免疫性骨质疏松症”，是一种以慢性炎症和线粒体功能异常为特征的疾病，这类状况会阻碍骨骼再生。线粒体DNA泄漏会激活cGAS–STING通路，引发过度炎症反应，进而抑制骨形成。与此同时，线粒体自噬功能缺陷会加剧线粒体损伤，形成骨丢失的恶性循环。本研究探讨了mtDNA-cGAS-STING轴在脂多糖诱导的骨髓间充质干细胞功能紊乱及炎症性骨丢失中的作用。我们让骨髓间充质干细胞暴露于脂多糖中，通过RT-qPCR、西方印迹法和免疫荧光法检测线粒体功能、mtDNA释放情况以及cGAS-STING通路的激活程度。随后，我们设计出能够同时递送针对STING和PINK1 mRNA的siRNA的外泌体，分别在体外以及脂多糖诱导的骨质疏松症小鼠模型中测试其對骨形成和线粒体稳态的影响。脂多糖处理会导致线粒体损伤、mtDNA泄漏以及cGAS-STING通路激活，进而抑制骨生成分化并增加炎症因子的表达。虽然抑制STING能减少炎症信号，但无法恢复线粒体功能；而过表达PINK1则能改善线粒体自噬功能，并部分抑制cGAS-STING通路的激活。通过siSTING/PINK1@Exo实现的双重调控能够在体外降低线粒体活性氧水平、恢复膜电位、促进骨生成相关标志物的表达并增强骨矿化作用。在体内模型中，经过双重调控的外泌体显著改善了骨小梁的微结构，降低了STING的表达水平，同时提高了RUNX2和OCN的表达水平，其效果优于单独使用某种干预措施。这些研究结果表明，通过工程化外泌体同时激活线粒体自噬功能并抑制STING活性，有望成为治疗炎症性骨质疏松症的有效策略，因为该方法能够同时解决线粒体功能异常和慢性炎症问题。

引言

骨质疏松症是一种以骨量减少和微观结构损伤为特征的疾病，全球范围内50岁以上的女性中有三分之一、男性中有五分之一患有此病，且随着人口老龄化，该病的患病率还在不断上升^[1]。从机制上来看，骨质疏松症是由于骨吸收与骨形成之间的失衡所导致的，这一失衡受到骨细胞功能异常以及雌激素缺乏、炎症、遗传因素等系统性因素的影响；不过，其发病机制至今仍未完全明确^[2]。近期，“免疫性骨质疏松症”这一概念被提出，该概念指出骨髓免疫炎症微环境的紊乱是推动骨质疏松症进展的重要因素^[3]。这种紊乱表现为慢性低度炎症，以及对损伤相关分子模式的高度敏感反应。这些损伤相关分子模式会通过增加骨吸收、减少骨形成来扰乱骨重塑过程，进而导致炎症老化现象^[2]。这类免疫功能失调可能是由与年龄相关的变化所引发的，这些变化会导致免疫细胞多样性下降、功能减弱，同时还会增加炎症因子的产生量[2], [4]。然而，导致这些免疫介导效应的初始机制仍不清楚。

越来越多的证据表明，线粒体功能异常，尤其是线粒体自噬功能受损，可能是免疫激活与骨丢失之间的关键关联因素[5], [6]。在正常生理状态下，细胞具备通过线粒体自噬途径识别并清除老化或受损线粒体的能力。但在衰老或氧化应激条件下，骨髓间充质干细胞的线粒体自噬活性会下降，从而导致受损线粒体积累，同时线粒体DNA以及其他损伤相关分子模式会释放到细胞质中[7], [8], [9]。这些损伤相关分子模式会被细胞内的模式识别受体识别，从而触发免疫反应^[10]。环鸟苷酸-AMP合成酶是一种细胞质中的DNA传感器，它能够识别侵入细胞的外源DNA以及细胞内的线粒体DNA^[11]。当细胞质中检测到异常DNA时，cGAS会合成信使分子2'3'-cGAMP。这种分子随后会与STING结合，进而启动一系列级联反应，招募TBK1蛋白，最终导致IRF3蛋白磷酸化并转移至细胞核中^[11]。这一过程最终会导致干扰素和促炎因子的释放，从而形成慢性炎症微环境，加速骨髓间充质干细胞的衰老进程并改变其分化方向[12], [13], [14]。尽管cGAS–STING通路在感染、肿瘤以及神经退行性疾病领域已被广泛研究[15], [16], [17]，但其在骨质疏松症中的作用仍有待阐明。最新研究表明，由于线粒体质量控制功能失效而导致的cGAS-STING通路异常激活，是推动骨髓炎症发展的重要因素。因此，有针对性地调控线粒体自噬功能以及cGAS–STING通路，以恢复线粒体稳态，或许能为缓解骨髓间充质干细胞的炎症反应提供有效策略。

外泌体是一种源自不同细胞的纳米级囊泡，为针对骨骼疾病开展靶向治疗提供了良好的平台^[18]。来自骨髓间充质干细胞的外泌体能够携带治疗活性物质，比如小干扰RNA或信使RNA，从而精准调控多种生物学通路[19], [20]。我们在之前的研究中已经发现，对诱导多能干细胞来源的间充质基质细胞的外泌体进行修饰，再向其加载针对Shn3基因的siRNA，能够促进成骨细胞的矿化作用，促使H型血管的形成，同时抑制破骨细胞的生成，进而提升骨质疏松症的治疗效果^[21]。因此，将针对STING基因的siRNA加载到骨髓间充质干细胞外泌体中，可以有效抑制cGAS-STING通路的激活。此外，由于线粒体自噬功能下降，受损线粒体会不断积累，而这正是mtDNA持续产生并释放的关键原因^[22]。恢复线粒体自噬功能同样能够抑制骨髓间充质干细胞的炎症反应。同时加载在识别受损线粒体并将其清除过程中起关键作用的PINK1蛋白的mRNA，不仅能够恢复细胞的线粒体自噬稳态，还能阻断cGAS-STING通路，有望实现“一石二鸟”的效果。这种同时抑制STING活性并激活PINK1介导的线粒体自噬功能的双重靶向策略，有潜力扭转骨髓间充质干细胞的炎症微环境，恢复骨骼系统的稳态。

本研究重点探讨mtDNA-cGAS-STING信号通路在骨髓间充质干细胞炎症损伤及骨质疏松症发展过程中的核心作用，并提出相应的干预策略。具体而言，我们将检测mtDNA向细胞质的泄漏情况、cGAS-STING通路的激活状态，以及这些因素对骨髓间充质干细胞功能的影响，从而明确这些因素与骨质疏松症之间的直接关联。基于这些研究结果，我们将构建同时负载STING基因siRNA和PINK1基因mRNA的骨髓间充质干细胞外泌体，旨在抑制STING介导的炎症信号，同时恢复依赖于PINK1的线粒体自噬功能，从而切断由mtDNA引发的炎症级联反应。最终，通过在炎症性骨质疏松症动物模型中验证这些双重靶向外泌体的骨保护作用，本研究将进一步阐明线粒体自噬功能与cGAS-STING通路的双重调控机制，为治疗炎症性骨丢失提供新的策略。

章节节选

细胞培养

人类骨髓间充质干细胞是从赛根公司购买的，培养时使用的培养基为含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的α改良Eagle培养基。这些细胞被置于37℃、含5%二氧化碳的湿化培养箱中培养。为了引发炎症反应，我们将这些骨髓间充质干细胞暴露于不同浓度的脂多糖中，处理时间分别为12小时或24小时，脂多糖的浓度分别为0、1.0、2.0、5.0或10.0微克/毫升。在恢复实验中，这些细胞先被1微摩尔的H-151抑制剂处理，

结果

脂多糖处理会导致线粒体损伤、线粒体DNA泄漏，同时激活cGAS-STING通路，这些因素共同作用会抑制骨生成分化，还会引发炎症反应，表现为炎症因子表达水平升高。具体来说，随着脂多糖浓度的增加，细胞的存活率会显著下降，在脂多糖浓度为10.0微克/毫升时，12小时后的细胞存活率约为11%，24小时时约为12%（见图2A）。通过钙黄绿素AM进行荧光染色后

讨论

骨免疫学领域的越来越多的证据表明，骨质疏松症与炎症反应以及免疫功能失调密切相关，这反映出骨骼系统与免疫系统之间存在广泛的相互作用^[24]。还有越来越多的证据表明，伴随衰老出现的慢性低度炎症，即炎症老化现象，在加剧骨丢失、扰乱骨重塑过程中起着关键作用[25], [26]。这类与年龄相关的炎症在骨质疏松症的发病机制中发挥着重要作用

结论

本研究明确了mtDNA–cGAS–STING信号通路在炎症性骨质疏松症发病机制中的核心作用，证明同时激活线粒体自噬功能并抑制STING活性是一种极具前景的治疗策略。通过设计出能够同时递送针对STING和PINK1基因的siRNA的外泌体，我们成功解决了线粒体功能异常和慢性炎症这两个问题，从而在体外和体内环境中都提升了骨形成效率并促进了骨重塑作用。这种新的

作者贡献说明

王金武：实验验证、软件应用、方法设计。 夏永军：项目指导、软件应用、资源提供、方法设计。 郭媛媛：论文撰写与修改、实验验证、项目指导、资源提供、项目管理、方法设计、数据整理、研究构思。 傅德豪：论文撰写与修改、实验验证、项目指导、资源提供、项目管理、方法设计、资金筹集、数据整理、研究构思。 徐宇：实验研究、数据整理分析。

数据可用性

所有支持性数据均收录在文章的正文及补充文件中，如有需要，相应作者也可提供这些数据。

利益冲突

所有作者均声明不存在任何利益冲突。

伦理问题

所有的动物实验都是严格按照美国国立卫生研究院的《实验室动物护理和使用指南》进行的，同时也获得了上海第六人民医院动物实验伦理委员会的批准（批准编号为2023-0327）。

利益冲突声明

? 作者们声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益或个人关系：傅德豪表示自己获得了中国国家自然科学基金的资金支持。其他作者则声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号为82370889）以及中国国家重点研发计划（项目编号为2023YFC2411300）的支持。

Kaiwen Zheng|Benchi Che|Yongzhi Cui|Han Yang|Yu Xiang|Yanchun Gao|Pei Liu|Zhiyong Mu|Jinwu Wang|Yongjun Xa|Yuanyuan Guo|Dehao Fu

上海交通大学医学院附属上海第六人民医院骨科，中国上海200233