《Franklin Open》：Loss of microglial ATM drives synaptic pruning and cognitive impairment in epilepsy
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摘要小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，对氧化应激极为敏感，且在维持突触稳态中起着关键作用。虽然癫痫会引发严重的氧化还原失衡，但氧化应激究竟如何改变小胶质细胞的功能并破坏突触完整性，目前仍不清楚。本研究显示，癫痫发作会独立于常规的DNA损伤反应，导致小胶质细胞中的ATM蛋白过
摘要
小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，对氧化应激极为敏感，且在维持突触稳态中起着关键作用。虽然癫痫会引发严重的氧化还原失衡，但氧化应激究竟如何改变小胶质细胞的功能并破坏突触完整性，目前仍不清楚。本研究显示，癫痫发作会独立于常规的DNA损伤反应，导致小胶质细胞中的ATM蛋白过早丢失。ATM蛋白缺失会使小胶质细胞进入过度吞噬状态，出现形态学激活以及异常的突触吞噬现象。通过对人类颞叶癫痫样本的单核转录组分析发现，ATM表达水平较低的小胶质细胞亚群表现出激活的转录特征、溶酶体处理功能增强以及突触重塑现象，同时神经元与这些细胞的配体-受体相互作用也发生了显著变化。在小胶质细胞中恢复ATM蛋白的表达可以减轻异常的吞噬活动，进而恢复突触完整性和认知功能。从机制上来看，ATM蛋白能够维持CREB的磷酸化状态，从而保证G6PD依赖性的NADPH生成及抗氧化能力，而这两者的功能受损会导致线粒体氧化损伤以及过度的小胶质细胞突触修剪。综上，我们的研究揭示了一个与DNA损伤无关的ATM-CREB-G6PD调控轴，该轴有助于限制氧化应激和异常的小胶质细胞吞噬作用，同时也表明ATM蛋白的丢失是癫痫中突触病理发生的重要驱动因素。
引言
癫痫是一种高发性的慢性神经系统疾病，全球约有7000万人深受其害。该病的特点是神经元活动异常且过度同步，从而导致反复发作的癫痫发作，进而引发持续的神经生物学改变，并给患者带来沉重的认知和心理社会负担[1]。近几十年来，癫痫发作的治疗取得了显著进展，美国食品药品监督管理局已批准26种抗癫痫药物用于治疗局灶性及全面性癫痫[2]。然而，这些疗法主要针对癫痫发作的症状，无法改变疾病的根本病理过程。因此，仍有相当比例的患者会出现各种并发症，其中最常见的是学习和记忆方面的认知障碍，这类障碍影响约25%-50%的癫痫患者，且目前现有的药物治疗手段对其效果甚微[3]。这些局限性凸显出有必要探究那些非神经元层面的机制，它们或许在疾病进展和认知功能障碍中起着重要作用。
传统上，癫痫的发病机制主要被认为是由神经元网络活动异常所导致的，但越来越多的证据表明，胶质细胞能够主动感知神经元的高兴奋状态并作出相应反应，进而推动疾病的进展[4][5]。在各类胶质细胞中，小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，在维持组织结构完整性和突触稳态方面发挥着至关重要的作用。通过一系列高度动态的反应机制，小胶质细胞能够持续监测神经微环境，实时检测突触活动、代谢状态以及细胞应力情况，同时还能有选择地清除那些多余或功能异常的突触[6][7]。但在病理状态下，小胶质细胞的活化功能出现紊乱，会导致它们异常地吞噬那些结构完好的突触，进而引发多种神经系统疾病中的突触丢失和认知功能障碍，癫痫便是其中之一。面对持续的神经元应力，小胶质细胞会在形态、转录和功能层面发生显著的变化——这些变化被认为与癫痫脑组织内的细胞代谢和氧化还原稳态变化密切相关。
在细胞层面，不同的神经细胞类型具有特定的代谢模式；不过，包括神经元和小胶质细胞在内的大多数脑内细胞，都需要依靠线粒体的氧化磷酸化作用来满足其巨大的能量需求[8]。因此，维持线粒体的结构完整对于保持细胞稳态、避免有毒代谢产物的积累至关重要。癫痫是一种对能量需求极高的病理状态，反复的神经元过度活跃会给局部代谢环境带来巨大压力，最终导致多种细胞类型的线粒体功能紊乱和结构损伤[9]。与这一观点相符的是，对癫痫脑组织的神经病理学分析发现，尤其是海马区，存在大量受损线粒体的异常积累现象[10]。除了承担生物能量生成的功能外，线粒体还是氧化磷酸化过程中活性氧的主要来源[11]。在癫痫脑组织中，癫痫发作带来的持续代谢负担会大幅增加线粒体中活性氧的生成量，进而对线粒体DNA、脂质和蛋白质造成氧化损伤。作为代谢活性极高的免疫细胞，小胶质细胞尤其容易受到这种氧化环境的影响；其线粒体结构完整性和氧化还原稳态的破坏，已被认为是导致小胶质细胞病理性活化及神经炎症反应的关键因素[12]。
丝氨酸/苏氨酸激酶ATM蛋白原本被认为是DNA损伤信号传导的核内介质，但实际上它也广泛存在于线粒体和过氧化物酶体中，在这些细胞器中执行多种非核功能[13][14]。蛋白质组学分析表明，ATM蛋白会在氧化应激作用下选择性地磷酸化特定亚群的底物，从而形成一种与常规DNA损伤反应在机制上有所区别的氧化应激响应信号通路[15]。在生理状态下，小胶质细胞中的ATM蛋白充当氧化还原传感器，能够独立于DNA双链断裂和MRN复合体激活的情况，实时监测活性氧水平的波动，进而启动适应性抗氧化机制，以维持细胞稳态[16][17]。因此，ATM蛋白缺失的细胞会对氧化应激表现出极高的敏感性，而小胶质细胞中的ATM蛋白丢失会导致活性氧持续积累、细胞稳态被打破，同时细胞还会向促炎表型转变[18][19]。
除了作为应力传感器之外，氧化应激激活的ATM蛋白究竟是如何将氧化信号与小胶质细胞的代谢适应过程联系起来的，目前仍不清楚。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作为磷酸戊糖途径的限速酶，在维持NADPH依赖的抗氧化防御机制中起着核心作用，尤其是在代谢需求较高的情况下[20][21]。磷酸戊糖途径的通量下降以及NADPH含量减少会进一步加剧氧化应激和神经炎症反应；不过，调控小胶质细胞中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的上游信号机制至今仍未被完全阐明[22][23]。通过综合生物信息学分析，我们发现了一条此前未被认识到的调控通路，这条通路通过CREB依赖的转录调控机制，将活性氧激活的ATM蛋白与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达联系起来。鉴于CREB是一种已知的转录激活因子，能够调控包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在内的多种代谢相关基因和生存基因，因此ATM蛋白通过调控CREB的活性，为氧化应激感知与小胶质细胞抗氧化代谢适应之间的联系提供了新的机制解释[24][25]。
本研究证实，小胶质细胞对癫痫发作引发的氧化应激的适应，依赖于一个ATM-CREB-G6PD信号通路，该通路将氧化应激感知与代谢调控紧密结合起来。我们发现了另一种此前未被认识到的机制：癫痫发作后ATM蛋白的丢失会干扰CREB依赖的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶转录调控，进而导致NADPH稳态失调、线粒体氧化损伤以及小胶质细胞的异常吞噬活动。通过这一机制，小胶质细胞的代谢功能障碍会将持续的氧化应激与癫痫脑组织中的异常突触重塑联系在一起。
章节节选
C57BL/6J小鼠及伦理声明
实验用雄性C57BL/6J小鼠（6周龄，体重20-25克）购自中国南京的GemPharmatech有限公司。这些小鼠被饲养在无特定病原体的动物设施中，所处的环境条件为22±2℃，光照周期为12小时亮灯/12小时黑暗。小鼠可自由获取标准饲料以及食物和水。为了尽量减少小鼠的痛苦，实验时采用二氧化碳吸入的方式对其实施安乐死。所有实验操作均遵循美国国立卫生研究院发布的《实验室动物护理和使用指南》。
神经元高兴奋性会在无DNA损伤的情况下下调ATM蛋白表达
神经元的高兴奋性会显著改变细胞外的微环境，从而形成一种能够直接影响胶质细胞功能的动态信号环境。为了研究这类环境变化如何影响小胶质细胞的行为，我们采用了Sombati培养系统，该系统是一种成熟的、可用于模拟癫痫样神经元高兴奋性的体外模型。通过分子标记物和电生理记录方法，我们确认了该模型能够成功诱导神经元高兴奋性现象（见图S1A–K）。这一结果与我们之前的研究结论一致。
讨论
本研究揭示了癫痫中一条此前未被发现的信号通路，该通路通过神经元高兴奋性降低小胶质细胞中ATM蛋白的表达，进而引发小胶质细胞异常活化以及过度的突触清除。我们发现，类似癫痫发作的神经元活动会在不触发常规DNA损伤信号传导的情况下，选择性抑制小胶质细胞中的ATM蛋白表达，而ATM蛋白的丢失又会扰乱CREB依赖的转录程序，进而影响葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达以及其他相关基因的调控。
CRediT作者贡献说明
谭明娟：数据整理。王磊：数据整理。赵金宇：数据整理。王友丽：数据整理。胡阳：论文初稿撰写、数据整理、概念设计。朱新健：论文审阅与编辑、研究指导、资金申请、数据整理。齐洪刚：数据整理。杨久荣：数据整理。
利益冲突声明
? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金的资助（项目编号为82471486和81872846，后者由朱新健负责申报）。
胡阳|赵金宇|王友丽|谭明娟|王磊|齐洪刚|杨久荣|朱新健
南京医科大学南京第一医院检验科，中国南京210006
