stranded RNA-seq技术揭示了在酿酒酵母中，除了典型的NCR基因之外，还存在广泛的Gln3依赖性调控机制

《Fungal Biology》：Stranded RNA-seq uncovers widespread Gln3-dependent regulation beyond canonical NCR genes in Saccharomyces cerevisiae.

　　•基于链特异性的RNA测序技术可识别出酿酒酵母中对Gln3敏感的长非编码RNA。•典型的GATAAG序列富集现象表明Gln3可直接调控这些长非编码RNA。•通过计算分析方法，可确定在脯氨酸存在条件下NCR基因与附近长非编码RNA之间的关联。•基因间长非编码RNA SUT387能够以顺式作用方式调控PUT4脯氨酸转运蛋白基因的表达。•链特异性RT–qPCR技术可避免反义转录信号带来的假阳性结果。

引言
RNA测序技术能够获取生物样本基因组在特定时间点上所有转录出的RNA分子的序列，即转录组。随着测序技术的进步以及成本的降低，大量数据的生成与存储已成为可能。这使得那些因表达水平过低而此前无法检测到或被视作转录噪声的转录本得以被识别。因此，RNA测序技术极大提升了我们检测所有活跃转录区域的精度，进而证明了转录是贯穿整个基因组的普遍现象，这一现象被称为普遍转录（Vera和Dowell，2016）。由此可见，基因注释是一个持续的过程，通过这一过程可以识别、描述并分析不同的功能基因组产物，从而更深入地理解基因组的表达与进化机制（Abril和Castellano，2019）。

长非编码RNA是一种长度超过200个核苷酸的调控性RNA分子，它们在细胞发育的特定阶段表达。这类RNA具有多种功能，包括在转录、转录后及表观遗传层面调控基因表达，以及参与染色体失活和RNA剪接修饰等过程（Li等人，2021）。然而，在生物样本中可检测到的数千种长非编码RNA中，仅有少数被证实具有重要的生物学功能。虽然短非编码RNA很容易被归类为snRNA、snoRNA或tRNA，但由于长非编码RNA受到严格的调控，且在某些情况下会迅速降解，因此对其分类较为困难。一类已被充分注释的长非编码RNA是稳定未注释转录本，这类RNA在多种条件下都能稳定存在；而另一类寿命较短的转录本则被称为隐匿不稳定转录本，它们会很快被外体酶降解（Xu等人，2009）。此外，那些仅在减数分裂过程中可检测到的转录本被称为减数分裂未注释转录本，还有那些对特定降解过程敏感的转录本，如对Xrn1敏感的转录本，则被称为Xrn1敏感不稳定转录本（Van Dijk等人，2011）。

酿酒酵母是一种常被用于研究长非编码RNA的模型生物。在该物种中的研究发现，长非编码RNA参与了基因表达的调控，帮助细胞应对环境变化或生长条件的影响（Yamashita等人，2016）。目前，人们已经发现酿酒酵母中的长非编码RNA参与了多种细胞过程，比如呼吸作用（Haidara等人，2022）、rRNA加工（Balarezo-Cisneros等人，2021）、孢子形成（Moretto和van Werven，2017）、膜成分的生物合成（Nova?i?等人，2020）、氨基酸转运蛋白的表达调控（Awasthi等人，2020），以及高浓度酒精环境下的抗性表现（Lázari等人，2022）。

基因间的长非编码RNA位于编码基因之间的非编码区域，其表达可受双向启动子调控，或在无核小体区域不受调控地转录，亦或是依靠自身的启动子来控制（Jiang和Pugh，2009；Wu等人，2012；Xu等人，2009）。最常见的顺式调控机制是串联转录干扰，即某长非编码RNA在编码基因的启动子区域转录，从而阻止相应的转录因子识别其结合位点，进而抑制该编码基因的表达（Shuman，2020）。另一种观察到的机制是启动子区域的染色质结构发生部分改变，使得转录向其他方向进行，间接抑制编码方向的基因表达（Jangid等人，2018）。尽管大多数研究都集中在长非编码RNA及其所调控基因的特性分析上，但对于长非编码RNA本身的调控机制了解甚少，目前还不清楚它们的表达是否依赖于转录因子，还是持续稳定地进行。

氮代谢物阻遏机制可通过负向调控那些用于利用非优先氮源的基因——主要是转运蛋白和分解酶——来实现对优先氮源的利用（Fayyad-Kazan等人，2016）。在存在优先氮源时，受此机制调控的基因表达水平较低；而当优先氮源耗尽后，两种GATA型转录激活因子Gln3和Gat1就会促进NCR相关基因的表达（Scherens等人，2006）。这一机制还伴随着两种转录抑制因子的存在，它们会竞争同一个识别位点，即Gzf3和Dal80（Soussi-Boudekou和André，1999）。尽管Gln3和Gat1这两种激活因子会竞争同一个识别位点，但它们所调控的NCR基因并非完全相同（Scherens等人，2006），这说明存在对Gat1和Gln3都有响应的NCR基因。

由NCR机制调控的基因所转录出的非编码RNA数量众多，尤其是在氨基酸转运蛋白附近（Awasthi等人，2020）；因此，源自这些基因位点的长非编码RNA很可能与NCR调控蛋白的调控功能密切相关。

在本研究中，我们采用链特异性RNA测序技术来分析依赖Gln3的转录组，旨在确定除了已知的NCR基因外，Gln3是否也调控长非编码RNA的表达。我们的目标是探究Gln3的调控作用是否不仅限于核心的氮代谢过程，从而明确长非编码RNA在基因调控中的作用，并了解Gln3对其他代谢途径，如细胞壁合成过程的影响。此外，我们还试图阐明特定的调控基因与长非编码RNA之间的顺式相互作用，重点关注跨膜转运蛋白。最后，本研究强调了链特异性分析在实现准确差异表达分析及正确验证基因表达方面的重要性。总体而言，这种方法有助于揭示Gln3通过编码基因及长非编码RNA网络所发挥的更为广泛的作用。

研究材料与培养条件
本研究所使用的所有菌株均基于CLA1背景（野生型）构建（Avendano等人，1997），具体信息详见补充表1。YPD培养基的成分包括10 g/L酵母提取物（BD；Bioxon）、20 g/L蛋白胨（BD；Bioxon）以及2%（w/v）葡萄糖（J. T. Baker）。最小培养基则含有1.7 g/L不含氨基酸的酵母氮源以及2%（w/v）葡萄糖（J.T. Baker），或者0.5%半乳糖（CTR SCIENTIFIC）；同时还含有0.1%（w/v）脯氨酸（SigmaAldrich）、谷氨酰胺（SigmaAldrich）或铵盐。

缺失菌株的构建
我们以NATMX基因为选择标记，通过改进后的Gutiérrez-Escobedo等人（2013）的实验方案，通过融合PCR技术构建了基因敲除突变菌株。本研究使用的所有引物均列于补充表2中。对于每一个目标基因的删除，我们需要分别扩增三种PCR产物：（1）两侧带有Flp1识别序列（FRT）的NATMX基因标记序列；（2）目标长非编码RNA序列的5’端上游片段。

在本研究中，我们提供了关于Gln3介导的基因调控的高分辨率转录组分析结果，其中包括编码基因的注释信息以及长非编码RNA的相关数据。Gln3和Gat1这两种GATA家族的转录因子被认为是主要的NCR基因激活因子，它们在GAP1、PUT4、GDH2、DAL2、DAL5、BAT2、OPT2等基因的调控中起着关键作用，不过不同转录因子所调控的基因种类似乎也存在差异（Magasanik和Kaiser，2002）。

首先，我们希望对NCR系统的调控作用进行全面分析，以确定Gln3的调控范围是否超越了传统的NCR基因。

Gln3转录因子是氮代谢物阻遏机制的核心调控因子，它通过GATA型结合位点来协调细胞对不同质量氮源的转录响应。典型的NCR启动子，比如DAL7调控区域，具有复杂的结构，其中包含多个GATA序列 motif，这些序列能够整合来自Gln3、Gat1、Gzf3和Dal80等多种因子的激活或抑制信号（Rai等人，1999）。我们的研究结果也与这一观察一致，因为NCR编码基因的表现确实符合这一特征。

结论
本研究进一步拓展了Gln3介导的调控功能范围，证明了它的调控作用不仅限于编码蛋白质的NCR基因，还广泛影响着长非编码RNA的表达。这一发现为理解长非编码RNA如何精细调控基因表达提供了新的视角。最后，鉴于反义转录和基因间转录在真菌基因组中极为普遍，将长非编码RNA纳入调控框架之中，对于全面理解真菌的基因调控机制而言至关重要。

作者贡献说明
Lina Riego-Ruiz：负责文章的撰写与修改、项目监督、资源协调、项目管理、资金筹集以及研究构思工作。Alfredo Trujillo-Rodríguez：负责初稿撰写、软件应用、研究方法设计、实验实施、数据统计分析、数据整理以及研究构思。Nicolás Gómez-Hernández：负责研究方法设计、项目管理工作以及实验结果的验证。

数据可用性声明
本研究生成的原始测序数据已存放在NCBI序列读取档案库中，对应的提交编号为BioProject ID PRJNA1417269。经过处理的数据库、计数矩阵以及所有用于数据分析的自定义脚本也都发布在GitHub平台上，地址为：https://github.com/alfredotruj06/Stranded-RNA-Seq-reveals-an-extended-role-of-Gln3-regulation-beyond-NCR-genes。

利益冲突声明
? 作者们声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益或个人关系：Alfredo Trujillo Rodriguez表示自己获得了科学、人文、技术及创新秘书处的财政支持。其他作者则声明自己没有已知的可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

致谢
作者们要感谢农业、医学和环境生物技术国家实验室（LANBAMA）为研究提供的测序服务及相关设施支持。同时，也要感谢咨询委员会成员Irene Casta?o博士、Alejandro Pereira-Santana博士以及Daphne Edith Gonzalez-Juarez博士所提供的宝贵意见和学术指导。最后，第一作者还要感谢SECHITI机构提供的奖学金（编号767083），以及在论文修订期间获得的额外资助。

Alfredo Trujillo-Rodríguez|Nicolás Gómez-Hernández|Lina Riego-Ruiz