《Genes & Diseases》：Functional splice site variants in AVPR1A protect against idiopathic hyperaldosteronism
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特发性高醛固酮血症（Idiopathic hyperaldosteronism, IHA）是高血压的常见形式，即使在推荐药物治疗后仍将增加心血管事件风险。由于 IHA 发病机制尚不清楚，阐明遗传因素可能发现新的治疗靶点。研究人员在重庆原发性醛固酮增多症研究（C
特发性高醛固酮血症（Idiopathic hyperaldosteronism, IHA）是高血压的常见形式，即使在推荐药物治疗后仍将增加心血管事件风险。由于 IHA 发病机制尚不清楚，阐明遗传因素可能发现新的治疗靶点。研究人员在重庆原发性醛固酮增多症研究（Chongqing Primary Aldosteronism Study, CONPASS）队列中对 261 例 IHA 患者及 261 例年龄与性别匹配的健康对照者外周血进行全基因组测序（Whole-genome sequencing, WGS）。研究人员观察到 IHA 与编码已知介导肾上腺细胞增殖的精氨酸加压素受体的 AVPR1A 基因中罕见、杂合的单核苷酸剪接变异（c.971-2A>C）之间存在强相关性。体外（In vitro）实验中，该剪接变异大幅阻断 AVPR1A 下游通路。AVPR1A 过表达导致 CYP11B2 基因表达上调 >25 倍，并显著增加醛固酮及其前体分泌（P < 0.001），而携带该剪接变异的 AVPR1A 过表达则挽救了这些效应。AVPR1A 敲低显著抑制醛固酮生物合成，CYP11B2 表达降低 80%（P < 0.001），醛固酮水平下降 50%（P < 0.001）。体内（In vivo）实验中，AVPR1A 过表达导致 CYP11B2 表达与循环醛固酮水平均显著升高（P < 0.05）。综上，AVPR1A 中致病变剪接位点变异赋予了对 IHA 的实质性保护作用。
研究背景方面，原发性醛固酮增多症（Primary aldosteronism, PA）是导致继发性高血压的主要原因，其特征是肾上腺皮质自主过度产生醛固酮，导致血浆醛固酮水平升高和肾素活性受抑。特发性高醛固酮血症（Idiopathic hyperaldosteronism, IHA）亦称双侧肾上腺增生，是 PA 的主要亚型，占高血压人群的 3%–6%，且伴随高心血管风险，即便接受盐皮质激素受体拮抗剂（Mineralocorticoid receptor antagonists, MRAs）推荐药物治疗，其心血管事件与死亡风险仍高于原发性高血压人群。目前 IHA 发病机制尚不明确，阐明其遗传因子有助于发现新的药理靶点。既往全基因组关联研究多聚焦混合亚型 PA 的常见变异，基于芯片分型平台难以捕捉罕见变异贡献，而罕见变异对疾病易感性的影响可能是识别潜在药物靶点的关键途径。因此，研究人员通过开展 CONPASS 队列的全基因组测序研究，旨在挖掘与 IHA 相关的罕见编码变异，最终发现 AVPR1A 基因剪接位点变异对 IHA 具有保护性作用，这一结论为 IHA 治疗提供了新的潜在靶点方向，该论文发表在《Genes》。
为开展本研究，研究人员采用几个主要关键技术方法：首先建立倾向评分匹配（1:1）的病例对照研究，样本来源于重庆医科大学附属第一医院招募的 261 例符合内分泌学会指南诊断的 IHA 患者与 261 例健康对照者；使用北京基因组研究所（BGI）DNA 纳米球测序技术（DNBSEQ）平台进行 150 bp 双端全基因组测序，序列比对至 GRCh38 参考基因组，采用基因组分析工具包（GATK）HaplotypeCaller 进行变异调用与联合基因分型；针对次要等位基因频率 < 0.01 的变异，使用 SAIGE-GENE 进行基因水平负担分析，基于 13 种功能掩码及不同聚合等位基因频率分层检验基因与 IHA 的关联；体外实验采用人胚胎肾细胞（HEK-293T）与人肾上腺皮质癌细胞（H295R）进行转染、剪接报告检测、激素与基因表达测定；体内实验通过尾静脉注射腺相关病毒（AAV）在 C57BL/6J 雄性小鼠中实现 AVPR1A 过表达，并进行肾上腺与血清生化分析；统计方面采用 SAIGE 调整协变量，实验数据使用 t 检验或 ANOVA 并做多重检验校正。
研究结果部分依次如下。全基因组测序与变异注释：研究人员对 CONPASS 队列 258 例 IHA 与 256 例对照进行质控后分析，共注释 27,189,903 个变异，包括 SNPs 与 InDels，大部分位于内含子与非编码区，少量位于编码区如剪接位点、移码等。通过 13 种掩码负担分析，AVPR1A 是与 IHA 关联最显著的基因，其预测功能缺失（pLOF）及 pLOF 联合错义变异在对照组中频率更高（MAC = 8），而在 IHA 病例中缺失（MAC = 0），显著降低 IHA 风险（OR: 0.86, 95% CI [0.79–0.93], P < 8.22 × 10–5）。AVPR1A（c.971-2A>C）导致 AVPR1A 结构改变：研究人员构建野生型与突变型 AVPR1A 小基因质粒转染 HEK-293T 细胞，电泳显示突变转录本更短，Sanger 测序鉴定出 MT1（85 bp 缺失）与 MT2（52 bp 缺失）两种异常剪接模式，均致外显子 2 移码。AlphaFold 预测显示突变导致细胞内 C 端结构域（氨基酸 345–418）丢失，该区域对 G 蛋白偶联及下游信号至关重要。AVPR1A（c.971-2A>C）诱导 AVPR1A 功能缺失：功能实验表明该剪接变异选择性破坏 Gαq/11-PLC 信号，突变 AVPR1A 的 pERK 水平在无 AVP 刺激时降低，AVP 诱导的 pERK 上调被削弱，pCREB 无显著变化，总 ERK 与 CREB 不受影响，说明变异影响信号效率而非蛋白表达。AVPR1A 调控体外醛固酮生成：在 H295R 细胞中，过表达全长 AVPR1A 显著提升醛固酮、18-羟基皮质酮与皮质酮水平，降低 11-脱氧皮质酮，伴随 CYP11B2 与 STAR 上调，CYP21A2 与 HSD3B2 下调；突变型 AVPR1A 逆转上述改变。AVPR1A 敲低则使各类皮质类固醇下降，CYP11B2 与 CYP11A1 下调，HSD3B2 上调，表明前体可用性与终末酶活性降低共同损害醛固酮合成。AVPR1A 调控体内醛固酮生成：通过 AAV 介导小鼠肾上腺 AVPR1A 过表达，研究发现血浆皮质酮、18-羟基皮质酮与醛固酮显著升高，孕酮与 11-脱氧皮质酮不变；肾上腺 CYP11B2 表达上调，肾脏肾素（REN）转录受抑，证实 AVPR1A 通过激活 CYP11B2 促进醛固酮生成并对肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）产生负反馈。AVP 信号参与 AVPR1A 相关醛固酮合成：研究人员用 AVP 激动剂与 SR49059 拮抗剂处理过表达细胞，发现 AVP 刺激增加类固醇激素，SR49059 抑制所有测量激素，共处理不能恢复，说明 AVPR1A 介导的醛固酮合成依赖配体激活并可被药理抑制。
讨论部分总结：研究人员在讨论中指出，本研究首次报道 AVPR1A 中新型保护性剪接变异可能抵御 IHA，体外与体内实验均证实 AVPR1A 过表达显著增加醛固酮合成酶表达与醛固酮生成，敲低则抑制该过程，提示该变异作为功能缺失等位基因通过减弱此通路降低 IHA 易感性，沉默 AVPR1A 或成 IHA 新疗法。既往基于 SNP 芯片的 GWAS 仅捕获常见变异，本研究借助 WGS 在 CONPASS 队列发现罕见杂合剪接变异具强保护性，确立 AVPR1A 在 IHA 发病中的新角色。已有横断面研究显示 PA 患者血浆 copeptin（AVP 替代标志物）升高，AVPR1A 在醛固酮产生腺瘤中表达且 AVP 灌注增加醛固酮并被拮抗剂阻断，支持 AVP-AVPR1A 参与 PA；本研究进一步通过体内过表达模型确立因果关系并鉴定人群新型剪接变异，结构预测与功能实验证实质变致 AVPR1A 功能缺失。研究优势在于 CONPASS 队列 WGS 及 UK Biobank 外显子数据验证，并有体外体内功能验证；局限在于变异仅在中国人群检出、未构建特定点突变动物模型而用敲低与过表达模拟。结论部分翻译为：综上，研究人员利用全基因组测序首次鉴定出 AVPR1A 中致病变剪接位点变异对 IHA 赋予实质性保护。体外与体内功能验证证实了 AVPR1A 在调控醛固酮生成中的关键作用。研究结果初步支持 AVPR1A 作为探索 IHA 治疗靶点的潜在选择。
