《International Journal of Biological Macromolecules》：Pullulan-coated zein nanoparticles: Ideal delivery vehicles to achieve the encapsulation of quercetin and protection of its antioxidant activity
编辑推荐：
摘要槲皮素是一种具有高抗氧化活性的天然黄酮类化合物，但由于其水溶性差且不稳定，在水基体系中的应用十分有限。为解决这些问题，本研究开发并表征了玉米醇溶蛋白-普鲁兰复合纳米粒子，用于包裹和保护槲皮素。首先通过反溶剂诱导的自组装方法，利用疏水相互作用和氢键制备了玉米醇溶蛋白纳米粒子以及
摘要
槲皮素是一种具有高抗氧化活性的天然黄酮类化合物，但由于其水溶性差且不稳定，在水基体系中的应用十分有限。为解决这些问题，本研究开发并表征了玉米醇溶蛋白-普鲁兰复合纳米粒子，用于包裹和保护槲皮素。首先通过反溶剂诱导的自组装方法，利用疏水相互作用和氢键制备了玉米醇溶蛋白纳米粒子以及负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米粒子。随后，通过静电相互作用将亲水且可生物降解的多糖普鲁兰沉积在上述纳米粒子表面，从而形成相应的复合纳米粒子。优化后的复合纳米粒子具有核壳结构，封装效率较高且形态呈球形。表面涂覆普鲁兰显著提升了纳米粒子的亲水性，这一结论可通过水接触角测定得到证实，同时也有助于提高其热稳定性和储存稳定性。在4℃下储存12天后，这类复合纳米粒子仍能保持88.10±0.16%的槲皮素保留率。此外，无论是原始玉米醇溶蛋白纳米粒子还是负载型纳米粒子都具备较强的抗氧化能力。这些结果表明，玉米醇溶蛋白-普鲁兰复合纳米粒子是一种极具潜力的抗氧化递送系统，既能保护疏水性生物活性物质，又能使其适应水基环境，有望被应用于水溶性抗氧化膜中。
引言
黄酮类化合物广泛存在于各种植物中，包括蔬菜、花卉、水果和茶叶等。作为一类黄酮类化合物，槲皮素具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎和抗菌作用[1]、[2]。这些活性有助于减少氧化应激、炎症和微生物感染，从而有益于人类健康；同时还能通过延缓氧化反应、抑制腐败微生物的生长来提升食品的质量与安全性[3]、[4]。然而，由于槲皮素的化学结构限制，其应用受到了很大制约。该化合物的分子结构由三个苯环（A、B和C环）构成平面共轭体系，这种稠合芳香结构使其具有很强的疏水性，难以与极性水分子发生作用，从而导致其在水基体系中的溶解度很低[5]、[6]。这些特性使得槲皮素难以在可水溶的基质中使用。此外，槲皮素还容易受到氧化和光照的影响，进而影响其生物活性[7]、[8]、[9]。因此，寻找一种既能保护槲皮素又能提升其在水基基质中应用效果的方法显得尤为重要。
近年来，随着纳米技术的发展，纳米封装被证实是保护生物活性物质的有效策略。对于槲皮素这类疏水性生物活性化合物而言，纳米封装能够提升其在水中的分散性，增强其物理化学稳定性，同时防止其在加工和储存过程中被降解。正因如此，纳米封装逐渐成为解决槲皮素水溶性差和稳定性不足问题的重要途径。目前已有多种用于递送槲皮素的体系被开发出来，包括乳剂、纳米粒子和脂质体等。乳剂载体或许可以提高亲脂性槲皮素在水基配方中的分散性，但这类体系通常需要使用表面活性剂，且稳定性较差，其在乳化过程和储存期间可能会发生聚结和奥斯特瓦尔德熟化等物理失稳现象[10]。脂质体虽然能为槲皮素提供生物相容性的双分子层结构，但其长期应用会受到载药量泄漏、在极端pH值或高温条件下发生聚集或破裂，以及磷脂氧化等问题限制，这些都可能影响其在水基基质中的稳定性[11]、[12]。喷雾干燥技术虽可将槲皮素制剂转化为干粉，但在加工过程中，高温空气和高能量雾化作用可能会导致槲皮素发生热降解[5]、[13]。因此，纳米粒子越来越被视为理想的解决方案，因为它们不仅能更好地保护槲皮素免受氧气和光照的影响，还能提升其在水中的分散性，并实现槲皮素的缓释作用[14]。
为提升槲皮素的稳定性，人们已经探索了多种载体系统。例如，Hassan等人[15]开发了一种基于蛋白质/多糖的递送系统，利用果胶、玉米醇溶蛋白和β-环糊精来包裹槲皮素，实验发现，在4℃条件下，槲皮素的浓度可保持两周不变。这些结果表明，载体辅助递送是提升槲皮素稳定性的有效方法。在各类载体材料中，蛋白质因其来源广泛、生物相容性好以及出色的递送性能而被认为具有较大应用潜力[16]。其中，玉米醇溶蛋白因其两亲性以及包裹疏水性生物活性物质的强大能力而尤为值得关注[17]。由于其疏水性，玉米醇溶蛋白可以通过反溶剂法自组装成纳米粒子，这不仅简化了纳米粒子的制备过程，也简化了相关的动力学机制。反溶剂法因能通过降低溶剂质量促使玉米醇溶蛋白自组装成纳米粒子而被广泛用于纳米粒子制备领域。此外，该方法操作简单、条件温和，非常适合用于包裹疏水性化合物。此前已有许多关于基于玉米醇溶蛋白的纳米粒子制备的研究，这些研究涵盖了阿魏酸、姜黄素和肉桂醛等多种生物活性营养物质的包裹与递送[18]、[19]、[20]。不过，玉米醇溶蛋白的疏水性限制了其在亲水体系中的应用，还可能导致纳米粒子结构不稳定。因此，人们通常会引入多糖来稳定水基分散体系中的纳米粒子。
常见的用于稳定玉米醇溶蛋白基纳米粒子的多糖包括可溶性大豆多糖、黄原胶以及其他带负电的生物聚合物，它们主要通过提升胶体稳定性、改善疏水性生物活性物质的包裹效果和递送性能来发挥作用。而在本研究中，选择普鲁兰作为亲水涂层多糖，不仅是因为它具有亲水特性，还因为它在食品包装领域有着重要的应用价值[21]、[22]、[23]、[24]。普鲁兰是一种水溶性外源多糖，由毛壳菌经发酵产生。这种线性葡聚糖主要由通过α-(1→6)糖苷键连接的三糖单元构成，形成了α-(1→4)和α-(1→6)键交替出现的独特结构。其独特的分子结构使其具有很高的柔韧性和粘附性，同时还具备优异的阻氧性能[25]、[26]。此外，美国食品药品监督管理局也将其列为安全可用的物质。
多糖通常带有负电荷，因此可以利用静电相互作用加速多糖在蛋白质纳米粒子表面的沉积，进而提升体系的pH值、离子环境以及储存稳定性[27]。由于普鲁兰具有亲水特性，相比普通的稳定多糖层，它能够在纳米粒子表面形成一层水合层，从而提升玉米醇溶蛋白/槲皮素纳米粒子的分散性和储存稳定性，同时也有利于未来将其整合到活性包装基质中。值得注意的是，被包裹在纳米粒子内的槲皮素仍能保持其原有的抗氧化活性，这样一来，这种纳米粒子体系就兼具载体和活性成分的双重功能，形成了一种高效的抗氧化递送平台。
因此，本研究的目的是开发并表征负载槲皮素的玉米醇溶蛋白-普鲁兰复合纳米粒子，作为一种有望用于未来食品包装领域的抗氧化递送系统。研究过程中，选择槲皮素作为与包装应用相关的模型抗氧化物质，以此评估所设计的纳米粒子系统是否能够提升其在水中的相容性以及储存稳定性。首先，通过疏水相互作用和氢键的自组装方法制备了玉米醇溶蛋白纳米粒子以及负载槲皮素的玉米醇溶蛋白纳米粒子。为了进一步提升纳米粒子的稳定性和表面性能，又通过静电相互作用和氢键将普鲁兰涂覆在这些纳米粒子表面，从而得到相应的复合纳米粒子。随后对这些复合纳米粒子的物理化学性质以及储存稳定性进行了评估。本研究的意义在于探讨普鲁兰作为包装用涂层材料的适用性，为开发可用于未来活性食品包装的玉米醇溶蛋白-普鲁兰复合纳米粒子提供理论依据。该研究不仅有助于开发稳定且具有水溶性的抗氧化纳米载体，也为这类载体在功能性水溶性抗氧化膜中的应用奠定了基础。
章节要点
材料
玉米醇溶蛋白粉末（来源：SLCN6870；CAS编号：9010-66-6）购自美国Sigma-Aldrich公司。普鲁兰（分子量362–480 kDa，产品编号HY-W1–45522）购自英国剑桥的Cambridge Bioscience公司。纯度≥95%的槲皮素以及2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）均购自美国Sigma-Aldrich公司，而浓度≥99.5%的乙醇则购自英国莱斯特郡的WVR Chemicals公司。所有试剂均为分析级产品。
玉米醇溶蛋白纳米粒子及玉米醇溶蛋白/普鲁兰纳米粒子的制备
玉米醇溶蛋白纳米粒子以及相应复合纳米粒子的制备流程和结构示意图如下：
pH值对粒子性质的影响
在pH值为3–5的条件下制备的玉米醇溶蛋白纳米粒子如图2A所示。当将玉米醇溶蛋白溶液滴入去离子水中时，由于疏水相互作用和氢键的作用，就会形成这类纳米粒子[29]。所有制备得到的纳米粒子尺寸均低于120纳米，多分散系数也小于0.20。普鲁兰和玉米醇溶蛋白纳米粒子的ζ电位情况如图2B所示。由于玉米醇溶蛋白的等电点大约在6.2–6.8之间，因此在pH值为3–5时这类纳米粒子带正电，而在pH值为6–8时则带负电。在所有测试条件下，普鲁兰均呈现负电性。
结论
在本研究中，通过将玉米醇溶蛋白溶液滴入去离子水中，成功制备出了玉米醇溶蛋白纳米粒子。这一现象可能是由于玉米醇溶蛋白中的疏水区域会自发向内折叠，从而形成疏水核心。与此同时，玉米醇溶蛋白在疏水相互作用和氢键的作用下会发生自组装，进而形成结构紧密且稳定的纳米粒子核心，这种结构有助于维持纳米粒子的完整性，避免其发生宏观聚集。当将槲皮素加入这些纳米粒子中时……
作者贡献说明
孙佳琳：论文撰写——审阅与编辑、论文撰写——初稿撰写、软件应用、方法设计、正式数据分析、数据整理。Megan Povey：论文撰写——审阅与编辑、研究指导。Wing-Fu Lai：论文撰写——审阅与编辑、研究指导。Paraskevi Paximada：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、资金筹集工作。
利益冲突声明
所有作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究还得到了中国国家留学基金委的支持（项目编号：202406330027）。
Jialin Sun|Megan Povey|Wing-Fu Lai|Paraskevi Paximada
