利用连接型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸对葡萄糖酸杆菌酒精脱氢酶和短乳杆菌NADH氧化酶进行多模块固定，用于D-阿洛酮糖的生物合成

《International Journal of Biological Macromolecules》：Multi-module immobilization of Gluconobacter frateurii alcohol dehydrogenase and Lactobacillus brevis NADH oxidase with tethered nicotinamide adenine dinucleotide for D-allulose biosynthesis

　　

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  通过化学手段将NAD⁺与GfADH连接，可提升酶与辅因子的空间接近度。
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  使用结合物及NOX后，NAD⁺的需求量降低了13倍。
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  通过依次招募的方式，将NAD⁺-GfADH结合物与NOX共同固定。
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  共固定化处理提升了酶的稳定性，同时促进了辅因子的再生。

引言

绿色生物制造技术的进步在很大程度上依赖于酶催化技术在合成功能性糖类、精细化学品以及药品等高价值化合物方面的高效应用[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。然而，尽管酶的应用十分广泛，但仍面临诸多固有挑战，比如酶的稳定性较差、难以回收，以及由于反应体系中辅因子浓度较低而导致其利用效率低下[8]、[9]、[10]、[11]。因此，提升酶的稳定性以及辅因子的利用效率已成为生物催化领域的重要研究目标。

目前，固定化酶技术已被证明是提升酶的稳定性、可回收性以及催化性能的有效方法。不过，传统的固定化方法往往存在活性位点被掩盖以及物质传输效率低的问题，这些都会限制酶的催化性能[12]、[13]。为解决这些问题，人们开始探索控制酶在载体上定位的方法，比如定向固定化以及运用先进材料，这些方法被视为极具前景的策略[14]、[15]、[16]、[17]。特别的是，SpyTag/SpyCatcher系统可以通过促进分子间异肽键的自发形成来实现定向固定化，从而确保酶的活性位点能够处于最佳状态[18]、[19]。在最近的研究中，多种基于Spy系统的生物催化剂，比如D-阿洛酮糖3-差向异构酶以及共固定化的醇脱氢酶/醛酮还原酶，都展现出比相应游离酶更高的催化效率[3]、[16]、[19]。此外，金属仿生纳米结构也因其极高的表面积、可调控的孔隙率以及能够控制酶的定位能力，而被视为酶固定化的理想载体[17]。先前的研究表明，自组装的双金属杂化纳米花所形成的紧凑结构能够有效保护D-阿洛酮糖3-差向异构酶，进而提升该酶的耐酸能力[20]。另外，将Spy偶联技术与仿生矿化技术相结合，可以实现PET水解酶的共固定化，这不仅减少了酶之间的空间距离，还显著提升了中间产物的传输效率[21]。这些全新的固定化策略对于开发在食品、制药以及环境保护等领域具有广泛应用前景的高性能生物催化剂至关重要[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。

不过，尽管通过固定化技术提升了酶的稳定性，但如何解决辅因子再生以及高效利用的问题，依然是依赖辅因子的固定化酶应用中的关键难题。近期已有不少针对辅因子局部再生的策略被成功应用，包括辅因子共封装、肽桥融合、静电辅因子通道，以及封装技术与离子吸附技术的结合[8]、[28]、[29]、[30]。这些方法的目的是通过提高酶周围微环境中的辅因子浓度，来降低辅因子的消耗并提升催化效率。在该策略中常用的辅因子再生酶包括甲酸脱氢酶（FDH）、葡萄糖脱氢酶（GDH）、亚磷酸脱氢酶（PTDH）、乳酸脱氢酶（LDH）以及NADH氧化酶（NOX），而基于这类生物方法的辅因子再生方案通常被认为更加环保且条件更为温和[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]。此外，电化学辅因子再生也是一种极具前景的策略。在某些电化学系统中，辅因子会通过灵活的连接臂与相应的酶形成共价结合，之后将这种结合物固定在电极表面或其他载体上，从而实现辅因子的高效原位再生与循环利用[37]、[38]、[39]。这种借助固定化技术实现的辅因子再生系统，不仅能减少辅因子的消耗，还能将固定化技术与辅因子再生相结合。

目前的研究大多集中在酶的稳定化或辅因子再生方面，而要开发出一个能够同时解决这两类问题的集成系统，仍然面临诸多挑战。需要指出的是，相比酮糖3-差向异构酶，脱氢酶被认为更适于D-阿洛酮糖的生物合成，但由于辅因子供应不足以及酶的运行稳定性较差，其应用仍受到限制[40]、[41]。在本研究中，我们以Gluconobacter frateurii来源的脱氢酶（GfADH）作为模型酶，提出了一种定制的多模块固定化策略，用以克服上述限制。该策略包括将辅因子-酶结合物进行共价连接，随后让它们自组装成杂化纳米花，最后通过SpyTag/SpyCatcher系统有针对性地招募NADH氧化酶。这项研究不仅为D-阿洛酮糖的合成提供了一种高效、稳定且可重复使用的生物催化剂，同时还提出了一种新的协同多模块工程化方法，用于解决复杂的生物催化问题。

章节要点

材料

Gluconobacter frateurii来源的NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的编码序列（GenBank编号WP_099183078.1）是由中国苏州的GENEWIZ公司合成的。Lactobacillus brevis来源的NOX则保存在我们的实验室中。K₂HPO₄、KH₂PO₄、CoSO₄以及其他试剂均购自中国上海的Sigma-Aldrich公司。3-羧基苯硼酸（CBA）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）则从中国上海的MedChemExpress公司购买。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)

用于构建高效GfADH生物催化剂的多模块融合策略

在初步评估GfADH催化D-阿洛酮糖合成的条件时，发现最适宜的温度为50℃，pH值为7.0（见图1A和B）。通过添加适当浓度的Co²⁺，该酶的催化活性进一步提升（见图1C）。鉴于GfADH是依赖NAD⁺的酶，接下来我们研究了NAD⁺浓度对其催化活性的影响。实验结果表明，当NAD⁺浓度为15mM时，D-阿洛酮糖的转化率可达最高值

结论

我们开发出一种集成的多模块固定化策略，该策略通过将辅因子固定与有序的酶组装相结合，有效解决了无细胞生物催化过程中存在的辅因子依赖性问题以及酶的稳定性问题。将该策略应用于阿利醇转化为D-阿洛酮糖的过程中，不仅提升了NAD⁺的再生效率，还增强了GfADH的催化性能。通过将NAD⁺通过共价键固定在GfADH的活性位点附近

CRediT作者贡献说明

艾佳颖：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，验证，项目管理，数据整理，概念设计。严家军：验证，正式分析，数据整理。张宇欣：验证，数据整理。卢福平：方法学，概念设计。毛淑红：方法学，正式分析。蒋一勋：写作——初稿撰写，软件应用，方法学，数据整理。李雷：写作——初稿撰写，软件应用，方法学，正式分析，数据整理。秦慧敏：

关于写作过程中生成式AI及AI辅助技术的声明

声明：在准备本研究成果时，作者使用了AlphaFold3工具来预测蛋白质结构。在使用该工具/服务之后，作者对内容进行了必要的审阅和修改，并对最终发表文章的内容承担全部责任。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（编号2022YFD2101400）以及中国国家自然科学基金（编号32372279）的支持。同时，我们也感谢天津科技大学现代分析技术研究中心的周佳平女士在研究过程中给予的帮助。

Jiaying Ai|Jiajun Yan|Yuxin Zhang|Fuping Lu|Shuhong Mao|Yixun Jiang|Lei Li|Hui-Min Qin