光热驱动的序贯免疫治疗克服Brca1缺陷型三阴性乳腺癌对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制的耐药性

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Photothermal-driven sequential immunotherapy overcomes resistance to PARP inhibition in Brca1-deficient triple-negative breast cancer

　　

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）由于缺乏可药物化分子靶点以及存在深度免疫抑制性微环境，面临严峻的临床治疗挑战，因此亟需创新性治疗策略。尽管聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂（poly ADP-ribose polymerase inhibitors, PARPi）可利用BRCA突变肿瘤中的合成致死（synthetic lethality）机制，但其疗效会被肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）驱动的免疫抑制所削弱，而现有联合治疗策略仍无法突破这些耐药屏障。为解决这一问题，研究人员构建了一种温度响应性双层凝胶（double-layer gel, DLG），用于实现时空协调递送：温和光热治疗（mild photothermal therapy, MPTT）可重编程TAMs，从而瓦解免疫抑制性生态位；PARPi可诱导免疫原性肿瘤细胞死亡并释放损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）；延迟释放的抗CD47抗体（anti-CD47 antibody, aCD47）则阻断CD47–信号调节蛋白α（signal regulatory protein α, SIRPα）轴。在Brca1缺陷型TNBC模型中，该策略显示出以下作用：（1）MPTT激活干扰素基因刺激因子通路（stimulator of interferon genes, STING），触发TAMs再极化；（2）肿瘤来源双链DNA（double-stranded DNA, dsDNA）进一步强化抗肿瘤表型；（3）aCD47通过促进抗原交叉递呈（antigen cross-presentation）增强吞噬作用并激活T细胞。最终，该策略通过重塑免疫抑制性微环境，抑制了原位肿瘤/远端肿瘤及肺转移。该研究不仅揭示了物理能量介导免疫调控的新机制，也为TNBC治疗建立了由经验性药物联用转向理性设计时空级联治疗的新范式。

该论文发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》，围绕Brca1缺陷型三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂（poly ADP-ribose polymerase inhibitors, PARPi）易产生耐药这一关键难题，提出了一种以光热驱动为核心的时空序贯免疫治疗策略。研究背景在于，TNBC是侵袭性最强的乳腺癌亚型之一，缺乏可有效药物靶向的分子标志物，晚期患者5年生存率极低。尽管约15%–20%的TNBC患者携带BRCA1/2突变，理论上应对PARPi敏感，但其临床获益常被肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的免疫抑制状态显著限制。特别是肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）在TNBC微环境中占比高，是造成免疫抑制和PARPi耐药的重要细胞基础。因此，单纯依靠DNA损伤诱导的合成致死或单纯激活适应性免疫，均难以突破由TAMs主导的治疗屏障，这也是开展本研究的直接原因。

在这一背景下，研究人员将治疗切入点从传统的适应性免疫检查点阻断进一步前移至先天免疫调控，提出“先破除屏障、后放大疗效”的序贯治疗思路。其核心逻辑是：首先利用温和光热治疗（mild photothermal therapy, MPTT）将促肿瘤的M2样TAMs重编程为抗肿瘤的M1样表型，解除微环境中的免疫抑制；随后使用奥拉帕利（Olaparib, OL）诱导Brca1缺陷肿瘤细胞发生合成致死并释放损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）；最后通过延迟释放抗CD47抗体（anti-CD47 antibody, aCD47），阻断CD47–信号调节蛋白α（signal regulatory protein α, SIRPα）“别吃我”信号，进一步增强巨噬细胞吞噬和抗原交叉递呈，从而连接先天免疫与适应性免疫。研究结论表明，该策略不仅可显著抑制原位肿瘤，还可控制远端病灶与肺转移，并建立持久免疫记忆，显示出明显优于普通联合给药方案的治疗效果。

本研究的主要技术方法包括：研究人员采用液相剥离法制备黑磷纳米片（black phosphorus nanosheets, BP-NSs），负载OL后构建OL@BP-NSs，并进一步基于EPC/GDO脂质材料建立双层凝胶（DLG）递送系统，实现外层快速响应释放OL、内层延迟释放aCD47。体外部分使用Brca1敲低4T1细胞、MDA-MB-436细胞、骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs）及Transwell共培养体系，结合流式细胞术（flow cytometry, FCM）、Western blot、共聚焦显微镜、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）等分析极化状态、DNA损伤和STING信号。体内部分主要采用BALB/c小鼠原位TNBC模型、远端肿瘤模型和肺转移模型开展疗效及免疫分析。

在结果部分，论文首先以“3.1. Preparation and characterization of DLG (OL@BP-NSs+aCD47)”为题，系统介绍了递送平台的制备与表征。研究人员证实，OL@BP-NSs具有较高包封率和载药量，并在生理缓冲液中保持良好稳定性。进一步利用双筒注射方式构建外层含OL@BP-NSs、内层含aCD47的双层凝胶。流变学结果显示，外层凝胶在41.92 °C发生溶胶-凝胶转变，而内层凝胶转变温度高达81.49 °C，这一热响应梯度赋予体系明确的时序释放基础。体外与体内光热实验进一步证实，BP-NSs在808 nm近红外激光照射下具有稳定升温能力，可使局部温度越过外层凝胶相变阈值而不破坏内层结构。释放实验和荧光示踪结果共同证明，该系统可实现外层OL受光触发加速释放，而内层aCD47维持延迟、持续释放，完成明确的时空序贯递送。

在“3.2. OL@BP-NSs combined MPTT to inhibit Brca1-deficient tumor cell-driven polarization of BMDMs toward M2 phenotype”部分，研究人员首先构建了稳定的Brca1敲低4T1细胞系，并据此建立体外研究模型。温度筛选显示，43 °C可在尽量保护巨噬细胞活性的前提下实施MPTT。药敏实验显示，Brca1缺陷细胞对OL更敏感，而野生型细胞敏感性较低。共培养实验进一步揭示，若先对肿瘤细胞施加OL或OL@BP-NSs处理，再与BMDMs共培养，则肿瘤细胞死亡越明显，BMDMs向M1样极化越显著；而MPTT本身在该预处理模式中并不增加肿瘤杀伤，因此对M1极化促进有限。相反，在先建立肿瘤细胞与巨噬细胞相互作用后再施加治疗的模型中，Free OL和OL@BP-NSs均难以有效逆转M2样状态，提示已形成的M2样巨噬细胞可通过旁分泌机制保护肿瘤细胞免受PARPi损伤。此时，MPTT能够独立逆转M2样极化，并与OL@BP-NSs协同恢复肿瘤细胞对PARPi的敏感性，说明其主要作用是先拆除免疫抑制屏障。

在“3.3. OL@BP-NSs combined MPTT to overcome acquired PARPi resistance in Brca1-deficient tumor cells”部分，研究人员通过γ-H2AX检测DNA双链断裂水平，进一步阐明耐药逆转机制。在预处理共培养模型中，OL和OL@BP-NSs均可在肿瘤细胞中诱导递增的γ-H2AX信号，且这一变化与M1样BMDMs增加相一致，说明肿瘤细胞死亡及由此释放的双链DNA（dsDNA）可作为DAMPs促进巨噬细胞抗肿瘤极化。MPTT本身不引发明显DNA损伤，提示其并非直接依靠基因毒性发挥作用。而在后处理共培养模型中，Free OL和OL@BP-NSs诱导的γ-H2AX信号明显减弱，证明M2样巨噬细胞确实削弱了PARPi造成的DNA损伤。值得注意的是，OL@BP-NSs+MPTT组合可产生最强γ-H2AX信号，说明MPTT可解除M2样巨噬细胞介导的PARPi获得性耐药，从而恢复并放大合成致死效应。

在“3.4. OL@BP-NSs combined MPTT to activate STING signaling in BMDMs and amplify aCD47-mediated anti-tumor immunity”部分，研究人员将机制解析进一步聚焦于STING通路。Western blot结果显示，总STING蛋白在各组间无显著变化，而磷酸化STING（p-STING）在MPTT组中特异性升高，并在OL@BP-NSs+MPTT组达到最高水平。这提示MPTT能够通过非经典途径激活STING。进一步检测发现，热应激可增加BMDMs胞质中的线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA），从而为MPTT独立激活STING提供依据。ELISA结果显示，组合治疗显著提高了肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-β（IFN-β）、CXCL9和CXCL10分泌，证明其有效启动了STING下游促炎程序。随后，研究人员验证了aCD47在时间协调中的作用：对OL预处理后的濒死肿瘤细胞，M1样BMDMs吞噬能力增强，而aCD47可进一步呈浓度依赖性放大这一效应；在抗原交叉递呈实验中，aCD47同样增加了H-2K^b–SIINFEKL复合物表达，说明CD47阻断不仅促进吞噬，还提高了抗原加工递呈效率，为后续T细胞激活奠定基础。

在“3.5. DLG (OL@BP-NSs+aCD47) combined MPTT to suppress Brca1-deficient TNBC growth and reprogram the immunosuppressive TME”部分，研究人员在原位Brca1缺陷TNBC小鼠模型中验证了治疗效果。结果显示，DLG（OL@BP-NSs+aCD47）+L组在治疗后较早出现肿瘤缩小，至第21天其抗肿瘤效果显著优于其他对照组，并有20%的小鼠达到完全缓解。与自由药物联合组相比，其肿瘤体积明显更小，提示单纯成分叠加不足以复制时空递送带来的疗效。生存分析显示，该组60天生存率为80%，远高于其他组。TUNEL结果表明，该方案诱导了最强肿瘤细胞凋亡。安全性方面，各组体重稳定，主要器官未见明显病理损伤。免疫微环境分析显示，该治疗显著提高肿瘤内M1样TAMs比例并降低M2样TAMs比例，使M1/M2比值大幅上升；同时促进CD8⁺ T细胞浸润，增强IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞并减少TIM-3⁺耗竭表型，还提升了树突状细胞（dendritic cells, DCs）比例。肿瘤引流淋巴结（tumor-draining lymph nodes, TdLNs）中CD8⁺ T细胞也明显增加，说明该序贯策略可在局部微环境重塑基础上激活有效适应性免疫。

在“3.6. DLG (OL@BP-NSs+aCD47) combined MPTT to establish systemic anti-tumor immunity and immune memory to suppress distal tumor growth and lung metastasis”部分，研究人员进一步评价了系统性抗肿瘤作用。在远端肿瘤模型中，仅对原位肿瘤进行治疗即可显著抑制未直接处理的对侧肿瘤，且DLG（OL@BP-NSs+aCD47）+L组有20%的远端肿瘤达到完全缓解。血清检测表明，该组TNF-α、IFN-β、CXCL9、CXCL10等全身炎症及免疫激活因子水平显著升高，支持其可由局部治疗转化为系统免疫效应。在肺转移模型中，该方案使肺转移结节数降至PBS组的2.8%，病理切片亦证实转移灶显著减少。进一步分析TdLNs中的T细胞记忆亚群发现，该组初始型CD8⁺ T细胞下降，而总记忆CD8⁺ T细胞、效应记忆T细胞（TEM）和中心记忆T细胞（TCM）均明显上升，同时效应记忆CD4⁺ T细胞比例也增加，表明该策略不仅诱导短期杀伤，还建立了持久免疫记忆。

讨论部分指出，本研究的关键创新在于将治疗重点从单纯解除T细胞抑制，转向先对TAMs进行功能重编程，再以时空有序方式串联PARPi与CD47阻断。与同步释放的传统联合治疗不同，DLG通过外层先响应、内层后释放的设计，使MPTT优先重塑微环境，OL随后诱导肿瘤免疫原性死亡，aCD47最后放大巨噬细胞吞噬与抗原交叉递呈，避免了不合理同步激活可能带来的低效或免疫耗竭。研究还强调，MPTT激活STING并非依赖经典肿瘤dsDNA–cGAS–STING轴，而与巨噬细胞胞质mtDNA增加有关，这是物理能量介导免疫调控的重要机制补充。论文同时指出，该平台采用EPC/GDO等可转化脂质材料构建，具有一定转化潜力，但在临床推进前仍需进一步验证人源化模型中的适用性、优化MPTT参数，并系统评估凝胶长期滞留后的局部生物相容性。

研究结论部分可译为：本研究针对Brca1突变型TNBC中的关键治疗难题，即免疫抑制性肿瘤微环境，尤其是M2样TAMs占优势所导致的PARPi和免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）疗效受限，构建了一种经由双层凝胶（DLG）平台递送的时空序贯治疗策略。该策略中，MPTT首先通过非经典STING激活将TAMs重编程为抗肿瘤M1表型，从而拆除免疫抑制屏障；随后PARPi诱导合成致死并释放DAMPs；延迟释放的抗CD47阻断CD47–SIRPα轴，增强巨噬细胞吞噬和抗原交叉递呈。该“破除屏障—放大疗效”的级联过程在侵袭性TNBC模型中诱导了强效系统性抗肿瘤反应和长期免疫记忆，疗效显著优于常规联合治疗。DLG所实现的时间控制释放对于避免无效甚至适得其反的免疫耗竭、并克服药物耐受与免疫抑制双重阻力至关重要。该研究通过将治疗重点从适应性免疫再激活转向先天免疫TAMs重编程及先天—适应性免疫协同参与，为TNBC治疗提供了新的变革性范式。