通过表位切割设计表位聚焦疫苗

《ACS Central Science》：Design of Epitope-Focused Vaccines via Epitope Cleavage

　　

将血清抗体反应导向广谱中和抗体（broadly neutralizing antibodies, bnAbs）靶向表位的表位聚焦免疫原设计，是开发针对高遗传变异病原体的广谱疫苗的一种有前景的方法。在这里，研究人员介绍了一种称为表位切割的策略，该策略涉及“切割”一个表位，以将抗体从该表位引导至抗原的其他区域。研究人员通过两种独立方法证明了表位切割的实用性：环状排列（circular permutation）和蛋白水解切割（proteolytic cleavage）。研究人员首先通过环状排列严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV₂）刺突蛋白的受体结合结构域（receptor binding domain, RBD）设计了一种沙贝病毒疫苗候选物；随后，通过将TEV蛋白酶切割位点插入埃博拉病毒糖蛋白（Ebola glycoprotein, GP）的聚糖帽中，进行位点特异性表位切割，设计了广谱埃博拉病毒免疫原。通过切割每种抗原上的可变区域，与未修饰抗原相比，环状排列的RBD和切割的GP均引发了针对相关病毒增强的交叉反应性抗体，并减少了对“切割”表位的抗体反应。研究人员的结果表明，表位切割是一种在不损害免疫原性的情况下重新定向抗体反应的疫苗设计策略。

**论文解读：通过表位切割设计表位聚焦疫苗**

**研究背景与问题**

疫苗开发面临的主要障碍之一是，针对高序列变异病原体的疫苗往往引发株特异性免疫反应，难以提供广谱保护。免疫聚焦策略旨在通过将体液免疫反应导向病毒保守区域，实现对相关病原体群的广谱保护。然而，现有方法如表位掩蔽（例如超糖基化或聚乙二醇化学修饰）虽然可以空间阻断不需要的表位，但常会降低工程化免疫原的整体免疫原性，导致抗体滴度下降，需要多次加强免疫才能恢复。因此，迫切需要开发新的免疫聚焦技术，既能以表位特异性方式扰动抗原性和免疫原性，又不会削弱工程化免疫原的整体免疫原性。

**研究内容与结论**

本研究提出了一种名为“表位切割”的新免疫聚焦概念，灵感来源于病毒免疫逃逸策略中的熵掩蔽——抗原上高度柔性区域在与抗体结合时会给抗体带来熵惩罚。假设通过切割或破坏偏离靶点的表位，可以破坏其结构完整性，形成超柔性区域，从而降低B细胞受体识别该表位的难度，减少抗体反应。研究人员通过两种独立蛋白质工程方法实现了表位切割：环状排列和蛋白水解切割。首先，针对SARS-CoV-2的受体结合域（RBD），通过环状排列在超变受体结合基序中引入新末端，设计了RBD环状排列变体（RBDcp）。该变体保持了热稳定性和偏离靶点表位的抗原性，但失去了对RBM靶向抗体的结合。小鼠免疫实验显示，RBDcp诱导了更强的交叉反应性抗体，尤其是针对沙贝病毒clade 2和clade 3的RBD，并将抗体反应集中在保守表位（如class 3和class 4抗体靶向的表位）上，而维持了整体免疫原性。其次，针对埃博拉病毒糖蛋白（GP），通过将TEV蛋白酶切割位点插入GP聚糖帽的可变环中，并用TEV蛋白酶切割，实现了位点特异性表位切割。切割后的GP（cleaved R266-GP和cleaved F290-GP）选择性破坏了针对聚糖帽表位的抗体结合，而保留了其他表位（如基部和茎部）的结合。小鼠免疫实验表明，切割后的GP诱导了更强的针对所有六种埃博拉病毒物种的交叉反应性抗体，并增强了针对SUDV和BDBV的中和活性，同时将抗体反应从聚糖帽转向更保守的基部（base）和茎部（stalk）表位。该研究发表在《ACS Central Science》。

**关键技术方法**

本研究主要采用了两项关键技术方法：环状排列（circular permutation）和蛋白水解切割（proteolytic cleavage）。环状排列通过基因融合将蛋白质的天然N端和C端连接，并在目标表位内产生新末端，从而“切割”该表位。蛋白水解切割则是在目标表位中插入蛋白酶识别序列（如TEVCS），随后用相应蛋白酶（TEV蛋白酶）进行切割。两种方法均用于实现位点特异性表位切割，以重新定向抗体反应。小鼠免疫实验使用了BALB/c和C57BL/6小鼠，分别来源于Jackson Laboratories和Charles River。

**研究结果**

**1. 通过环状排列SARS-CoV₂受体结合域进行表位切割**
研究人员通过将RBD的天然N端和C端（残基319和533）用(GS)₄连接子融合，并扫描残基475–503以寻找新末端位置，鉴定出在残基487和488处具有新末端的环状排列变体RBDcp。RBDcp在哺乳动物细胞中表达水平最高，SEC洗脱谱与野生型RBD（RBDwt）相似，热稳定性相近（熔解温度约53 °C）。抗原性分析显示，RBDcp对class 1抗体CB6的结合降低超过1000倍，对class 2抗体C002的结合完全丧失，但对class 3、class 4和class 1/4抗体（SA58、S2X259、SA55）的结合维持不变，表明RBDcp在RBM区域引入了局部结构扰动，而未影响其他表位的抗原性。

**2. RBDcp诱导靶向保守表位的广谱泛沙贝病毒抗体反应**
小鼠免疫实验（MPLA/QuilA佐剂，四次免疫）显示，RBDcp诱导的针对SARS-CoV₂ RBD和全长刺突蛋白的血清IgG滴度与RBDwt相当，证明环状排列未降低免疫原性。交叉反应性测试表明，RBDcp组在免疫两次后，针对clade 2和clade 3沙贝病毒（Yun11、Rf1、BM48-31、BtKY72）RBD的抗体滴度显著高于RBDwt组，而对clade 1a和SARS-CoV₂变体的滴度相似。中和实验显示，RBDcp组对SARS-CoV₂ WA.1的中和滴度略低（但无统计学差异），但对clade 1a和clade 3沙贝病毒的中和活性与RBDwt组相当。竞争ELISA构建的免疫优势层级表明，RBDcp组8只小鼠的免疫优势集中在class 4抗体S2X259靶向的保守表位，2只集中在class 3抗体SA58，而RBDwt组则呈现不一致的混合层级，说明RBDcp将抗体反应从RBM上的class 1/2表位转向了更保守的表位。

**3. 蛋白水解切割实现埃博拉糖蛋白上的精确表位敲除**
研究人员以EBOV GP为模型，通过突变天然弗林蛋白酶切割位点（RRTRR→AGTAA）构建了Δfurin背景，并插入TEVCS至聚糖帽的11个位点，选出R266（顶部）和F290（侧面）两个位点。TEV蛋白酶切割后，还原凝胶显示R266-GP被切成两个相似大小的片段，F290-GP被切成约37 kDa和>50 kDa的片段。SEC-MALS表明所有GP变体均形成三聚体（约240 kDa），热稳定性接近（Tm约50–54 °C）。抗原性分析显示，切割后F290-GP对聚糖帽靶向抗体REGN3470的结合进一步降低（EC₅₀差异80倍），切割后R266-GP对c13C6的结合完全丧失，而对其他表位抗体（mAb114、c2g4、ADI-15946、ADI-15974）的结合维持，表明蛋白水解切割选择性破坏了切割表位的抗体结合。

**4. 切割的GP诱导针对多种埃博拉病毒物种的增强交叉反应性**
小鼠免疫实验（AddaS03佐剂，两次免疫）显示，切割后GP（cleavedF290-GP和cleavedR266-GP）诱导的针对EBOV GP的抗体滴度与GPwt相当，但针对其他五种埃博拉病毒GP（BOMV、SUDV、RESTV、BDBV、TAFV）的滴度显著更高，且全球几何平均滴度显著高于GPwt及其未切割对应物。中和实验显示，所有组对EBOV的中和滴度相似，而cleavedF290-GP组对SUDV的中和滴度显著高于GPwt，cleavedR266-GP组对BDBV的中和滴度显著高于GPwt。竞争ELISA表明，切割后GP诱导的抗体与聚糖帽抗体c13C6的竞争减少，而与基部抗体c2g4和茎部抗体ADI-15974的竞争增加，说明蛋白水解切割将抗体反应从聚糖帽转向了更保守的基部和茎部表位。

**总结讨论**

表位切割作为一种新策略，为设计表位聚焦疫苗提供了概念验证数据。环状排列适用于天然N端和C端邻近的蛋白质，而蛋白水解切割更适合具有柔性环表位的大抗原，但切割位点可能影响免疫原稳定性。目前只测试了单一位点切割，未来需探索多表位切割。血清阻断实验未能全面揭示免疫原引发的抗体表位景观，单B细胞分选或电镜多克隆表位作图可进一步阐明机制。增强的交叉反应性是否能在异源致死攻毒实验中提供保护，仍需后续研究。本研究有助于理解表位免疫原性的决定因素：调节表位的灵活性和/或稳定性可以降低其免疫原性。研究结论翻译如下：这些数据有助于理解表位免疫原性的决定因素；研究人员表明，调节表位的灵活性和/或稳定性可以降低其免疫原性。然而，似乎需要大幅改变表位的灵活性/稳定性才能降低对特定位点的抗体反应，因为简单插入蛋白水解位点并未显著影响埃博拉GP免疫原的免疫原性。研究人员的工作表明，通过多种蛋白质工程方法可以实现表位切割，以设计在两个无关病毒系统中具有增强交叉反应性的疫苗。这种方法有望应用于其他抗原，以设计有效的下一代表位聚焦疫苗。