基于多功能多糖的水凝胶，含有生物功能化透明质酸和积雪草苷负载的尼奥体在伤口愈合中的作用

《ACS Applied Bio Materials》：The Role of a Multifunctional Polysaccharide-Based Hydrogel with Biofunctionalized Hyaluronic Acid and Asiaticoside-Loaded Niosomes in Wound Healing

　　

先进的伤口敷料能够调节伤口微环境，实现持续的治疗递送，并限制病理性疤痕，这仍然是再生医学中的一个持续挑战。研究人员使用iota-和lambda-卡拉胶（iota- and lambda-carrageenan）制备了一种多功能纳米复合水凝胶，随后用CaCl₂进行离子交联。该水凝胶进一步用L-精氨酸（L-arginine）接枝的透明质酸（hyaluronic acid, HA）进行功能化，即HA?Arg，以增强细胞反应。另外，将装载积雪草苷（asiaticoside）的尼奥体（niosomes）掺入水凝胶中，以在纳米尺度提供治疗性生化信号。形成的尼奥体显示出纳米尺寸（±160 nm）、低多分散性（0.30 ± 0.04）、稳定的负表面电荷、高封装效率（高达82%），以及持续释放装载药物达72小时。通过各种结构和物理化学表征确定，研究人员建立了稳定的水凝胶，具有有利的多孔结构、溶胀行为、热稳定性以及纳米囊泡的均匀分布。在体外研究的水凝胶表现出优异的生物相容性、血液相容性以及增强的细胞-材料相互作用。体内装载尼奥体的制剂在第14天显示出约80%的伤口闭合，而对照组为70%。组织病理学分析揭示了炎症减少、血管增多、成纤维细胞增多以及胶原形成更好的组织化趋势，表明用于先进伤口护理产品的潜力。

伤口愈合是一个涉及多种细胞和细胞外基质成分协调作用的复杂生物学过程。慢性伤口（如烧伤、术后伤口、糖尿病伤口和创伤伤口）的治疗成本高昂，仅在美国，每年医疗费用超过255亿美元，且超过650万成年人受此健康问题困扰。传统伤口敷料多为被动屏障，存在机械稳定性不足、生物功能有限、药物释放不可控等缺陷。水凝胶因高含水量而接近软组织，可维持湿润愈合环境并作为药物储库，但传统水凝胶系统仍存在局限性。近年来，基于多糖（如卡拉胶、藻酸盐）、蛋白质（如明胶）和合成聚合物（如PEG、PVA）的水凝胶敷料被广泛研究，但缺乏多功能整合。积雪草苷（asiaticoside）是一种从积雪草中提取的三萜皂苷，可促进成纤维细胞活化、血管生成和细胞外基质形成；尼奥体（niosomes）作为非离子表面活性剂囊泡，具有高生物相容性和物理稳定性，能保护包封药物并实现持续释放。然而，将双卡拉胶/明胶水凝胶、生物功能化透明质酸（HA?Arg）和积雪草苷负载尼奥体整合为单一多功能平台的研究尚未见报道。为此，研究人员开发了一种多功能水凝胶敷料，旨在提供结构稳定性、持续生物活性递送和再生信号，并在全层切除伤口模型中评估其性能。该研究发表在《ACS Applied Bio Materials》。

研究人员采用的关键技术方法包括：通过EDC/NHS偶联合成HA?Arg共轭物；采用薄膜水化法制备积雪草苷负载尼奥体（Nio/Asi），并评估其粒径、ζ电位和封装效率；通过离子交联（CaCl₂）制备双卡拉胶（iota-和lambda-卡拉胶）/明胶水凝胶，并掺入HA?Arg和不同浓度的尼奥体，形成五种配方（Car-G、Car-G/H-Arg、Car-G/H-Arg/NA-0.5、Car-G/H-Arg/NA-1.0、Car-G/H-Arg/NA-2.0）。利用FT-IR、NMR、DSC、SEM进行结构表征；通过溶胀、降解、粘度、药物释放实验评估网络功能。体外细胞实验使用正常人成纤维细胞（NHF）和脂肪来源间充质干细胞（ASCs，由Biohellenika S.A.提供），进行MTT、BrdU、LDH、细胞粘附和划痕实验。体内实验采用雄性Wistar大鼠（每组5只，体重350-400 g）建立全层切除伤口模型，宏观观察伤口闭合率，并进行H&E和Masson三色染色组织病理学评分。

**3.1 积雪草苷负载尼奥体的表征**：通过DLS和ζ电位分析，三种尼奥体配方（Nio/Asi-0.5、-1.0、-2.0）均显示纳米级粒径（221-260 nm）、低多分散性（~0.3）、稳定负表面电荷（约-30 mV），封装效率随药物浓度增加而升高（最高达81.7%），SEM证实球形均一结构。

**3.2 HA?Arg共轭的结构确认**：¹H NMR图谱显示，在HA特征峰基础上，出现酰胺键形成的新信号（~2.80 ppm），证实了HA与Arg的共价接枝。

**3.3 复合水凝胶的物理化学和形态学性质**：FT-IR显示O?H/N?H、酰胺I/II、C?O?S等特征峰，证实HA?Arg和尼奥体成功整合。DSC显示热转变峰强度降低，表明分子运动增加和结构无定形化。SEM显示所有冻干水凝胶具有多孔互连结构，HA?Arg使孔壁更致密，尼奥体掺入后形成更均匀的孔隙（NA-1.0配方最均衡）。

**3.4 水凝胶网络性质和功能性能**：孔隙率约为72-78%，HA?Arg和尼奥体使孔隙率略有下降但仍>70%。溶胀实验显示双相曲线，中性pH（7.4）下初始快速吸水后稳定，HA?Arg和尼奥体明显改善水保留能力（如Car-G/H-Arg/NA-2.0在480 s后仍保持约1100-1300%）；酸性pH（5.6）下吸水减少。酶解降解实验显示14天后质量损失约65-83%，尼奥体加速降解。粘度测量显示剪切稀化行为，HA?Arg和尼奥体降低粘度但仍适用于涂抹。药物释放实验显示，游离积雪草苷24小时快速释放，而水凝胶-尼奥体系统实现双相释放（初始爆发后持续7天），累积释放量随尼奥体浓度增加（NA-2.0约75%）。

**3.5 体外细胞反应和再生行为**：MTT实验显示所有配方细胞活力>100%，48小时后Car-G/H-Arg和含尼奥体配方活力显著高于对照。BrdU实验显示DNA合成活跃，含尼奥体配方增殖率75-85%。LDH释放低于ISO 10993-5的10%阈值，表明无细胞毒性。细胞粘附实验中，Car-G/H-Arg使粘附增加超过400%，而含尼奥体配方呈剂量依赖性（NA-2.0恢复高粘附）。划痕实验中，含尼奥体配方（NA-0.5和NA-1.0）在48小时达到约85-90%伤口闭合，优于对照。

**3.6 血液相容性和止血性能**：血小板粘附实验显示Car-G/H-Arg/NA-2.0在30分钟时粘附率约85%；血凝指数（BCI）实验显示HA?Arg和尼奥体显著改善血凝效率（尤其前15分钟）；溶血实验显示所有配方溶血率<5%（除NA-1.0略高约7%，但仍在可接受范围），符合ISO 10993-4标准。

**3.7 体内伤口愈合评估（宏观分析）**：大鼠全层切除伤口模型显示，Car-G/H-Arg/NA-2.0组在第14天伤口闭合率约81%，显著高于对照组（约69%），且伴随更早的肉芽组织形成、减少痂壳、边缘平滑和毛发生长。

**3.8 伤口再生的组织病理学评估**：H&E和Masson三色染色显示，第14天含HA?Arg和尼奥体配方组炎症细胞浸润评分降低、血管增殖评分升高、胶原密度评分升高，但未达统计学显著性。组织趋向于更少炎症、更多血管、更多成纤维细胞和更有序的胶原排列，提示从炎症期向重塑期的正常过渡。

总结讨论部分：研究人员指出，HA?Arg中的精氨酸基团通过鸟氨酸-一氧化氮信号通路促进血管生成，而尼奥体持续释放的积雪草苷进一步协同增强成纤维细胞活化和胶原合成。组织病理学趋势表明，该水凝胶平台可能通过调节炎症微环境、加速血管化和基质重塑，促进伤口愈合。尽管部分参数未达统计学显著性，但整体趋势支持其作为多功能伤口敷料的潜力。

研究结论部分翻译：该研究成功开发了一种利用卡拉胶、HA?Arg共轭物和积雪草苷负载尼奥体的多功能生物活性水凝胶平台用于伤口愈合，并评估了其作为有前景的系统。积雪草苷负载尼奥体的表征显示形成了稳定的纳米囊泡，具有高封装效率，且HA?Arg共轭物有效整合后表面性质得以保持。FT-IR、DSC和SEM分析证实HA?Arg和尼奥体组分在保持水凝胶结构适应性前提下成功掺入卡拉胶中。制备的配方在可涂抹性、多孔互连网络、可调降解模式、可调溶胀能力和假塑性流变学方面展现出巨大潜力。由于双相释放，积雪草苷的初始治疗激活和后续持续补充显著增强了生物活性。体外研究证实了优异的细胞相容性和增强的细胞增殖（通过细胞活力、BrdU掺入和低LDH释放体现）。HA?Arg的掺入使无尼奥体系中的细胞粘附能力显著增强，几乎达到商用纤连蛋白板的水平。体内伤口愈合显示，水凝胶处理组表现出高伤口收缩率、更好的再上皮化和有序的胶原纤维沉积。组织病理学评估显示炎症减少、血管生成增加和肉芽组织重塑更早。总之，在卡拉胶水凝胶基础平台中，包含HA?Arg生物活性和积雪草苷的尼奥体表现出高度的协同作用。