基于血浆的LC-MS/MS方法检测和定量单胺类神经递质代谢物的优化与验证

《ACS Omega》：Optimization and Validation of Plasma-Based Assay for Detection and Quantification of Monoamine Neurotransmitter Metabolites Using LC–MS/MS

　　

生物胺的一个重要亚类是单胺类神经递质，包括多巴胺、血清素、去甲肾上腺素和肾上腺素神经递质。这些神经递质的生物合成途径共享几种共同的底物、代谢物、辅因子和酶。这些组分的基因突变导致一组罕见的遗传性疾病，称为单胺类神经递质代谢障碍（mNMDs）。现有研究报告了用于诊断的属于该途径的特定代谢物集合的测量方法，通常跨不同的生物基质，如脑脊液（CSF）、血浆、血清或尿液。因此，可用的检测方法和数据在方法学上是异质的。在生化途径中，疾病特异性代谢模式由多个上游和下游代谢物的配对改变产生，只有当这些代谢物在相似的分析条件下从同一生物基质中同时测量时，才能捕获这些模式。缺乏同时测量限制了代谢物比率的使用，而在mNMDs的情况下，代谢物比率具有诊断价值和基于模式的解释。在本研究中，研究人员报告了基于血浆的靶向液相色谱-质谱联用（LC–MS/MS）方法的开发、优化和验证，用于同时检测和定量单胺生物合成途径的11种关键代谢物。该检测方法针对样品制备、色谱分离、质谱检测进行了优化，并根据美国FDA M10生物分析方法验证和研究样本分析指南（2022年11月）进行了验证。该方法在宽范围内表现出良好的线性、高灵敏度和特异性、可接受的日内和日间精密度和准确度、可接受的变异系数以及较低的检测限和定量限。使用健康参与者的血浆样本进一步验证了该方法的适用性。由于mNMDs如果早期识别则可能得到治疗，这种经过验证的基于血浆的方法可以为当前使用的不同生物基质或侵入性CSF采样提供快速且可预测的替代方案，用于诊断，并具有对这些可治疗疾病进行纵向治疗监测的额外效用。

**研究背景与问题**
单胺类神经递质代谢障碍（mNMDs）是一组由单胺生物合成途径中基因突变引起的罕见遗传性疾病，涉及多巴胺、血清素、去甲肾上腺素和肾上腺素等神经递质及其辅因子四氢生物蝶呤（BH₄）。现有诊断方法主要依赖脑脊液（CSF）分析，但其侵入性限制了在儿童群体中的重复采样和纵向治疗监测。此外，现有研究常在不同生物基质（如CSF、血浆、血清、尿液）中测量有限的代谢物，导致数据异质性强，无法同时获取途径中上游和下游代谢物的完整关系，从而阻碍了基于代谢物比值的模式诊断。因此，亟需一种能在同一生物基质中同时检测多种关键代谢物的高灵敏度方法，以提供疾病特异性代谢模式，并作为CSF的微创替代方案。

**研究内容与结论**
研究人员开发、优化并验证了一种基于血浆的靶向液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）方法，用于同时检测和定量单胺生物合成途径中的11种关键代谢物：L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）、3-O-甲基多巴（3-OMD）、高香草酸（HVA）、5-羟基色氨酸（5-HTP）、5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇硫酸酯（MHPGS）、DL-4-羟基-3-甲氧基扁桃酸（VMA）、新蝶呤、墨蝶呤、二氢生物蝶呤（BH₂）和生物蝶呤。该方法根据美国FDA M10生物分析方法验证指南（2022年11月）进行验证，表现出良好的线性、高灵敏度、特异性和可接受的精密度与准确度。通过20名健康参与者（0–19岁）的血浆样本验证了临床适用性，所有代谢物均被成功检测和定量。该研究发表在《ACS Omega》。

**关键技术方法**
1. **LC–MS/MS分析**：采用Shimadzu Nexera X2 UPLC系统与SCIEX QTRAP 5500三重四极杆质谱联用，使用电喷雾电离（ESI）正负极性切换模式，通过多反应监测（MRM）进行定量。
2. **样品前处理**：血浆样本经蛋白沉淀（冰甲醇+0.2%甲酸）后离心，上清液干燥复溶，进样体积为2 μL（校准品/质控）或16 μL（未加标基质）。
3. **校准策略**：由于血浆中天然存在内源性代谢物，采用负x截距法生成血浆基质校准曲线，以准确量化内源性浓度。
4. **验证参数**：根据M10指南评估线性、检测限（LOD）、定量下限（LLOQ）、日内/日间精密度与准确度、稳定性（工作台、自动进样器、冻融）、基质效应、提取回收率、选择性和特异性。
5. **样本来源**：20份健康参与者（0–19岁）血浆样本，经TIGS机构伦理委员会批准并获取知情同意。

**研究结果**
- **方法开发与优化**：通过直接注入纯标准品优化了每个代谢物的电离极性、碰撞能量（CE）和去簇电位（DP），选择两个MRM过渡（定量和定性）以增强特异性。8种代谢物（L-DOPA, 3-OMD, 5-HTP, 5-HIAA, 新蝶呤, 生物蝶呤, BH₂, 墨蝶呤）在ESI正模式下监测，3种（VMA, HVA, MHPGS）在负模式下监测。采用Waters Atlantis dC18色谱柱，在6分钟内实现所有代谢物的基线分离。

- **线性、LOD和LLOQ**：在稀释溶液中建立2–500 ng/mL范围内的校准曲线，所有代谢物的决定系数（R²）>0.99。LOD范围为1–7.8 ng/mL，LLOQ范围为2–15.6 ng/mL，具体取决于代谢物。HVA的LLOQ最高（15.6 ng/mL）。

- **内源性代谢物评估**：通过负x截距法计算血浆基质中内源性代谢物的浓度，并纳入校准点，生成血浆基质校准曲线，线性响应一致。

- **精密度和准确度**：日内分析中，部分代谢物在高QC水平的准确度超出标准（±15%），但精密度（CV）在可接受范围内。日间分析（三个独立批次）中，所有代谢物的准确度和精密度均符合M10指南标准（均值准确度在85–115%内，CV≤15%）。

- **稳定性**：工作台稳定性（冰上5小时）显示除墨蝶呤外所有代谢物稳定；自动进样器稳定性（10°C）在24小时时除墨蝶呤和BH₂外均合格，48小时时更多代谢物偏离；冻融稳定性（三个循环）显示除墨蝶呤外，两个循环内稳定，第三个循环中BH₂和生物蝶呤不达标，提示蝶呤的氧化互变特性。

- **携带效应**：ULOQ后空白注射中未观察到显著携带效应（响应≤LLOQ的20%）。

- **基质效应和提取回收率**：基质因子（MF）显示离子抑制或增强，但日间实验的准确度仍在可接受范围内，表明基质效应不影响定量性能。提取回收率在低、中、高QC水平下CV≤15%，表明方法重现性良好。

- **选择性和特异性**：从六种独立来源的血浆中未观察到内源性共洗脱干扰，定性和定量过渡比例一致（变异≤20%），确认方法对目标代谢物的高选择性。

- **临床样本适用性**：20份健康参与者血浆中，所有11种代谢物均被成功定量，中位值高于LLOQ，验证了校准范围涵盖生理浓度。部分样本中生物蝶呤和墨蝶呤接近LLOQ，可能源于基质效应，但信号仍可检测。

**讨论与结论**
本研究首次报告了在同一基质、相同分析条件下同时检测单胺途径11种代谢物的验证LC–MS/MS方法。基于血浆的方法作为CSF的微创替代，为mNMDs的诊断和纵向治疗监测提供了工具。讨论指出，蝶呤代谢物（如BH₂和墨蝶呤）的稳定性受氧化还原特性影响，建议在临床解读中使用稳定蝶呤（新蝶呤和生物蝶呤）作为锚点，并推荐添加抗氧化剂（如二硫赤藓糖醇）以改善分析性能。该方法与既往CSF和血浆中代谢物模式的研究一致，支持其向临床转化。研究强调，未来需在mNMD患者队列中验证该方法与CSF模式的相关性，并建立统一基质和年龄组的参考区间。结论翻译：从风险收益角度来看，本研究中描述的检测方法可以有助于微创采样方法、改善诊断分层和治疗监测可治疗的mNMDs。重要的是，这种方法并非旨在削弱CSF分析的诊断价值，而是提供一种互补策略来评估单胺代谢信息以做出明智的诊断决策，同时减轻儿科患者的侵入性操作负担。单胺代谢障碍如果早期发现则可能得到治疗，并且需要治疗监测；因此，这种微创检测方法的可用性为评估mNMDs提供了有临床意义的选择。