肺炎链球菌传播由TNFR2+调节性T细胞驱动

《Frontiers in Immunology》：Pneumococcal transmission is driven by TNFR2+ regulatory T-cells

　　

背景：肺炎链球菌血清型1（序列型217）是撒哈拉以南非洲地区侵袭性疾病暴发的主要原因，导致显著的发病率和死亡率。了解高毒力菌株（如ST217）的传播动力学是开发可减少暴发发生率的疗法和疫苗的关键。方法：使用青少年小鼠肺炎链球菌传播模型研究ST217的传播动力学，该模型代表了撒哈拉以南非洲疾病暴发主要影响的人群。结果：研究人员发现，TNF受体2（TNFR2）阳性调节性T细胞（Tregs）矛盾地创造了促进ST217传播的条件。在ST217定植期间，TNFR2⁺ Tregs在鼻咽部积累并抑制产生IL-17A的γδT细胞和Th17细胞，导致中性粒细胞介导的肺炎链球菌清除减少。这种减弱的炎症反应增加了ST217携带密度，从而增加鼻部脱落至足以增加传播的水平。此外，研究人员表明，这些TNFR2⁺ Treg反应是菌株依赖性的，并由肺炎链球菌毒素肺炎溶血素驱动。低传播性血清型23F表现出低肺炎溶血素活性，导致TNFR2⁺ Treg反应受损。这反过来增强了γδT17-中性粒细胞轴的激活，促进肺炎链球菌清除并破坏23F传播。结论：本研究证明了TNFR2⁺ Tregs在高毒力肺炎链球菌传播中一个意想不到但关键的作用。

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是引起全球肺炎和细菌性脑膜炎的主要病原体，尤其在低收入国家构成重大健康负担。撒哈拉以南非洲地区持续发生肺炎链球菌脑膜炎暴发，主要影响（年轻）成人，其中血清型1（以序列型ST217为主）是导致侵袭性疾病的主要菌株。无症状鼻咽部携带是侵袭性感染的前提，并在宿主间传播中起核心作用，但传播过程中的细菌和宿主因素仍知之甚少。既往研究明确，辅助性T细胞17（Th17）通过产生白细胞介素-17A（IL-17A）招募巨噬细胞和中性粒细胞，对清除携带和防止定植至关重要；γδT细胞也是IL-17A的主要来源，参与病原体识别和早期免疫激活。调节性T细胞（Tregs）可抑制Th17和γδT细胞反应，在细菌感染中虽能减轻组织损伤，但同时也通过削弱细菌清除导致携带慢性化。肿瘤坏死因子（TNF）与TNF受体2（TNFR2）结合对Treg激活和Forkhead box P3（Foxp3）稳定化至关重要，且TNFR2⁺ Treg亚群具有最高抑制活性。然而，TNFR2信号在Treg介导的肺炎链球菌携带控制及其对传播的影响尚不清楚。鉴于不同菌株的携带动力学和传播率存在差异，高毒力菌株如ST217的传播动力学研究对于开发阻断传播和减少暴发发生率的有效疗法和疫苗具有重要意义。本研究旨在利用青少年小鼠宿主间传播模型（模拟撒哈拉以南非洲暴发主要影响年龄组）阐明这些相互作用，比较暴发相关ST217菌株与罕见引起侵袭性暴发的血清型23F的携带和传播动力学，重点关注肺炎链球菌-宿主相互作用及T细胞介导的携带和传播控制。论文发表在《Frontiers in Immunology》。

研究人员通过以下关键技术方法开展研究：使用青少年小鼠肺炎链球菌传播模型（需流感病毒IAV共感染以促进鼻部分泌物），细菌菌株来自马拉维布兰太尔女王伊丽莎白中央医院抗逆转录病毒治疗诊所的成人患者（包括ST217和23F），并构建ST217肺炎溶血素（Ply）敲除突变株（ST217Δply）。动物模型包括C57BL/6J野生型（WT）小鼠、TNFR2敲除（TNFR2^-/-）小鼠以及Foxp3^DTR/EGFP DEREG小鼠（用于通过白喉毒素特异性清除Tregs）。通过流式细胞术分析鼻咽部免疫细胞，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-17A和TNF水平，溶血活性测定评估Ply活性，全基因组测序（结合牛津纳米孔长读长和Illumina短读长测序）比较ply基因序列。

**研究结果：**

**高毒力血清型1的传播依赖于TNFR2信号**
通过比较WT和TNFR2^-/-小鼠作为指数小鼠的传播实验，发现ST217在WT小鼠中传播率为75%，而在TNFR2^-/-小鼠中显著降至25%（P=0.0391）。传播时间线显示，WT小鼠在感染后第2天即出现传播，而TNFR2^-/-小鼠延迟至第8天。WT小鼠的脱落水平从第6天升高，在第8-9天达到峰值，而TNFR2^-/-小鼠保持低脱落水平。设定脱落阈值2000 CFU，WT小鼠中36.2%的脱落事件超过该阈值，而TNFR2^-/-小鼠仅4.6%。携带密度在第8天后WT小鼠显著高于TNFR2^-/-小鼠，且该TNFR2介导的携带和脱落控制独立于IAV共感染。

**TNFR2信号在携带过程中抑制IL-17A介导的固有免疫细胞招募**
在感染第6天，TNFR2^-/-小鼠鼻咽部Treg比例显著低于WT小鼠，而中性粒细胞、γδT17细胞、Th17细胞的数量和频率均升高，且IL-17A水平升高。在无IAV共感染时，TNFR2^-/-小鼠也表现出类似的Treg减少和γδT17/Th17增加，以及巨噬细胞数量显著升高。这表明TNFR2信号通过维持Treg群体，抑制IL-17A产生，从而削弱中性粒细胞和巨噬细胞反应，允许ST217高密度携带。

**Treg清除增强IL-17A介导的中性粒细胞招募，导致早期携带期间脱落减少**
使用DEREG小鼠特异性清除Tregs后，感染第2-3天，γδT17细胞比例升高，IL-17A水平升高，中性粒细胞和巨噬细胞数量显著增加，脱落水平在第5-6天降低超过2倍。证实Tregs在早期抑制IL-17A介导的炎症，从而维持高脱落水平。

**低传播菌株23F激活TNFR2⁺ Treg反应的能力较弱**
比较ST217和23F的传播动力学，23F的传播率（8%）显著低于ST217（83%），传播延迟（第8天 vs 第7天），脱落水平显著更低，仅1.4%的脱落事件超过阈值（ST217为32.8%），且携带密度更低。在感染第2天，23F感染小鼠鼻咽部TNFR2⁺ Treg数量显著低于ST217，差异源于总Treg减少；第3天，23F感染小鼠的中性粒细胞和巨噬细胞数量、γδT17细胞频率和IL-17A水平均显著升高。表明Treg诱导是菌株依赖性的，低Treg反应导致增强的IL-17A介导清除，从而减少脱落和传播。

**肺炎溶血素（Ply）对Treg激活和宿主间传播至关重要**
ST217的Ply溶血活性显著高于23F。基因组测序发现23F的ply基因在氨基酸位置380存在一个非同义单核苷酸多态性，导致天冬氨酸（D）变为天冬酰胺（N），该突变位于Ply的膜结合域（结构域4），可能解释溶血活性差异。使用ST217Δply突变株，感染第2天TNFR2⁺ Treg反应降低，传播率降至25%（WT为83%），传播延迟，携带密度降至与23F相似水平，脱落水平在第8-9天显著降低，超过阈值的事件比例降至17.4%（WT为32.8%）。证明Ply是诱导TNFR2⁺ Treg反应和维持高携带密度所必需的，从而促进脱落和传播。

**总结讨论：**
本研究表明，TNFR2⁺ Tregs在高毒力肺炎链球菌血清型1（ST217）的宿主间传播中发挥关键作用，通过抑制IL-17A产生（来自γδT17和Th17细胞）和中性粒细胞/巨噬细胞反应，维持高鼻咽部携带密度，从而增加脱落水平，促进传播。这种免疫抑制效应具有菌株依赖性，低传播血清型23F因Ply活性低而无法有效诱导TNFR2⁺ Treg反应，导致增强的IL-17A介导清除和低传播。Ply通过其溶血活性驱动Treg激活，可能是肺炎链球菌在鼻咽部持续存在并驱动传播的机制之一。研究结论原文翻译如下：
“总之，我们的研究结果提供了对影响肺炎链球菌携带和传播的免疫因素的有趣见解。我们证明，Tregs显著有助于细菌感染的慢性化，并且有些出乎意料地促进了它们向新宿主的传播。阐明细菌感染期间激活Tregs的分子途径，并进一步研究Tregs的细胞靶标，对于全面理解呼吸道病原体与宿主之间的相互作用至关重要，更重要的是，开发新型Treg调节疗法以控制细菌脱落和传播。”