《Frontiers in Immunology》：Single-cell analysis reveals KLF10-high macrophages induced by glioblastoma cells are associated with tumor progression
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背景：胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是成人中枢神经系统最常见且最具侵袭性的原发性恶性肿瘤，尽管接受标准手术、放疗和化疗，近90%病例在两年内复发。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）在GB
背景：胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是成人中枢神经系统最常见且最具侵袭性的原发性恶性肿瘤，尽管接受标准手术、放疗和化疗，近90%病例在两年内复发。肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）在GBM复发中起关键作用，但其在复发性GBM中的特征仍不明确。Krüppel样因子10（Krüppel-like factor 10, KLF10）调控代谢、线粒体功能、增殖和凋亡；然而其在GBM相关TAMs中的作用尚不清楚。方法：研究人员分析了16例GBM样本的单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）数据以识别复发相关TAMs，使用基因本体（Gene Ontology, GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）和CellChat分析评估功能特征，利用标记基因通过最小绝对收缩与选择算子（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator, LASSO）和Cox回归构建预后特征，使用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据评估KLF10与临床病理特征的关联，建立GBM细胞–巨噬细胞共培养系统检测KLF10诱导，并使用KLF10过表达巨噬细胞评估对GBM细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果：研究人员识别出一个由KLF10、ZFAND2A、SMAD7、GPR84和ARHGAP12组成的五基因预后特征。KLF10表达与WHO分级、IDH突变、MGMT启动子甲基化、1p/19q共缺失、分子亚型和总生存相关，高KLF10预示不良预后。功能富集分析提示KLF10相关基因与细胞外基质–受体相互作用（ECM–receptor interaction）、细胞周期相关通路和细胞因子信号传导相关联。体外实验中，与GBM细胞共培养上调了THP-1衍生巨噬细胞中的KLF10表达，KLF10过表达巨噬细胞与GBM细胞增殖、迁移和侵袭增加相关。结论：KLF10-high巨噬细胞与GBM进展相关，可能作为需要进一步验证的候选预后标志物。
该研究围绕胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）复发机制与肿瘤免疫微环境（Tumor Microenvironment, TME）中肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）的功能异质性展开。GBM是成人中枢神经系统最常见且极具侵袭性的原发性恶性肿瘤，即便经过标准手术、放疗及替莫唑胺（Temozolomide）联合放化疗，仍有近90%患者在确诊两年内复发，中位生存期不足15个月。现有研究表明复发性GBM（recurrent GBM, rGBM）在分子特征、肿瘤异质性及免疫微环境方面均与初发肿瘤存在显著差异，其中TAMs作为主要浸润免疫细胞，被证实可通过免疫逃逸促进进展与治疗抵抗，但rGBM中肿瘤细胞重编程巨噬细胞的机制及其促瘤功能仍不明确。此外，Krüppel样因子10（Krüppel-like factor 10, KLF10）作为调控代谢、线粒体功能及细胞周期的转录因子，在多种肿瘤中被报道具有双重作用，但在GBM尤其是TAMs中的角色尚未阐明。因此，研究人员通过开展单细胞水平的免疫微环境解析与体外功能验证，旨在识别复发相关TAMs亚群并探究KLF10在该过程中的作用，最终构建基于单核细胞来源TAMs亚群的预后特征，为GBM进展机制与预后评估提供新线索。该论文发表于《Frontiers in Immunology》。
为开展上述研究，研究人员主要依托以下关键技术方法与数据来源：首先获取GSE182109数据集中的16例GBM单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）样本，使用Seurat与Harmony进行质控、整合与降维聚类；从UCSC Xena门户获取TCGA（The Cancer Genome Atlas）、GTEx的批量RNA测序（bulk RNA-seq）数据用于验证；采用CellChat推断细胞间配体–受体互作；利用clusterProfiler进行GO与KEGG功能富集；通过LASSO Cox回归结合100次重复筛选稳定基因构建五基因预后风险模型，并以CGGA队列验证；体外实验建立GBM细胞与THP-1衍生巨噬细胞的Transwell共培养体系，结合RT-qPCR、流式细胞术、CCK-8、EdU及Transwell迁移侵袭实验评估KLF10过表达对巨噬细胞表型及GBM细胞行为的影响。
研究结果如下：
3.1 Identification of marker gene expression profiles of macrophages associated with glioblastoma recurrence
研究人员对16例GBM样本的scRNA-seq数据进行聚类注释，识别出六大细胞群，其中GBM细胞与巨噬细胞占比最高。将巨噬细胞重聚为三类单核细胞来源TAMs（Mo-TAM1/2/3）与一类小胶质细胞来源TAMs（Mg-TAM），发现rGBM中Mo-TAM2比例显著升高而Mo-TAM1下降，且高Mo-TAM2浸润评分与患者总生存较差显著相关，提示Mo-TAM2为复发相关亚群。
3.2 GO and KEGG enrichment analysis of Mo-TAM2
对Mo-TAM2进行富集分析显示其显著富集于细胞因子–受体相互作用、ECM–受体相互作用、HIF-1信号通路及整合素信号等炎症与微环境重塑通路，生物学过程主要涉及白细胞迁移与趋化，细胞组分定位于黏着斑与胶原内含细胞外基质，分子功能富集于整合素结合与生长因子结合，表明其具备增强的迁移与基质互作能力。
3.3 Cell–cell communication between Mo-TAM2 and glioblastoma cells
CellChat分析揭示TAMs与各细胞群存在广泛互作，其中Mo-TAM2与GBM细胞通信强度最高，关键配体–受体轴包括SPP1–CD44、AREG–EGFR、PTN–SDC2/3等，提示Mo-TAM2通过细胞因子、黏附与ECM相关信号与肿瘤细胞密切对话。
3.4 Construction of a Mo-TAM2–based prognostic signature in glioblastoma
经LASSO Cox回归与100次重复筛选，研究人员保留KLF10、ZFAND2A、SMAD7、GPR84、ARHGAP12五基因构建风险模型。高低危组Kaplan–Meier分析显示高危组总生存显著更短，模型1/3/5年AUC分别达0.871/0.855/0.841，且在CGGA队列中得到验证；风险评分随WHO分级升高、IDH野生型、MGMT启动子非甲基化而增加。
3.5 Expression pattern and clinical relevance of KLF10 in glioma
KLF10在多种细胞表达但以巨噬细胞尤其是Mo-TAM2中较高，泛癌分析显示其在肿瘤与正常组织中异质表达。在胶质瘤中KLF10随WHO分级升高而上调，GBM高于低级别胶质瘤，IDH野生型、MGMT非甲基化及间质（MES）亚型中表达更高，高KLF10表达与不良总生存显著相关（p < 0.0001），在各亚组均具预后意义。
3.6 KLF10 expression correlates with glioblastoma progression and prognosis
差异表达与富集分析显示KLF10-high组上调VEGFA、COL1A2、LOX等基因，下调ALDH2、HDAC11等；KEGG富集于ECM–受体相互作用、细胞周期、细胞因子–受体相互作用，GO富集于细胞外基质组织、趋化、胶原内含细胞外基质及细胞因子活性，提示KLF10关联免疫应答与侵袭相关转录程序。
3.7 Glioblastoma cells upregulated KLF10 expression in macrophages
研究人员以100 ng/mL PMA诱导THP-1分化并用CD11b?流式验证，建立共培养体系，RT-qPCR结果表明GBM细胞共培养可显著上调巨噬细胞内的KLF10 mRNA表达，说明肿瘤细胞能诱导巨噬细胞KLF10升高。
3.8 KLF10-overexpressing macrophages were associated with increased proliferation, migration, and invasion of glioblastoma cells in vitro
通过质粒转染获得KLF10过表达巨噬细胞并验证效率，共培养后Transwell、划痕、CCK-8与EdU实验均显示，KLF10过表达巨噬细胞与GBM细胞迁移、侵袭及增殖能力增强相关，表明高KLF10巨噬细胞在体外具促GBM进展的关联表型。
讨论部分总结：研究人员指出GBM微环境复杂，TAMs在进展、免疫逃逸与耐药中起核心作用，且rGBM中髓系细胞状态转变已被关注，但通过何种分子调控复发相关TAMs功能仍不清。本研究通过scRNA-seq识别Mo-TAM2为复发富集亚群，并发现KLF10为其潜在标记，与不良预后及ECM重塑、细胞因子信号相关。与其他癌种中KLF10作为抑癌因子不同，GBM中KLF10高表达促进展，体外证实GBM细胞可上调巨噬细胞KLF10，且高KLF10巨噬细胞关联GBM细胞恶性表型增强，提示其可能对应一种GBM-supportive巨噬细胞状态而非经典M1/M2极化。研究者同时说明需在患者来源与原位模型中验证其生物学意义，THP-1衍生巨噬细胞无法完全模拟原代或患者来源TAMs，且KLF10主要经转录组识别，需在独立临床队列中行蛋白水平与空间验证以明确其作为预后生物标志物的价值。
结论部分翻译：总之，原发与复发GBM免疫微环境中的TAMs均呈现异质性，KLF10可能参与GBM中与复发相关的巨噬细胞特征。GBM细胞上调THP-1衍生巨噬细胞中的KLF10表达，且KLF10过表达巨噬细胞在体外与GBM细胞增殖、迁移和侵袭增加相关。这些发现提示KLF10可能作为与复发相关TAM特征及巨噬细胞–GBM互作关联的候选分子，然而THP-1衍生巨噬细胞无法完全重现原代人巨噬细胞或患者来源TAMs的生物学复杂性，需在具临床相关性的巨噬细胞模型中进一步验证。
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