《Frontiers in Immunology》：Integrating multi-omics data reveals IL-8 positive cancer-associated fibroblasts as mediators of chemotherapy-induced tumor progression in breast cancer
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背景：近期研究表明，尽管化疗可杀伤肿瘤细胞，但也可能诱导肿瘤微环境(TME)内细胞（尤其是癌症相关成纤维细胞(CAFs)）发生适应性改变，从而矛盾地促进肿瘤进展。本研究旨在探讨暴露于紫杉醇(PTX)或多柔比星(DOX)的CAFs在肿瘤进展中的作用并探索潜在机制
背景：近期研究表明，尽管化疗可杀伤肿瘤细胞，但也可能诱导肿瘤微环境(TME)内细胞（尤其是癌症相关成纤维细胞(CAFs)）发生适应性改变，从而矛盾地促进肿瘤进展。本研究旨在探讨暴露于紫杉醇(PTX)或多柔比星(DOX)的CAFs在肿瘤进展中的作用并探索潜在机制。方法：研究人员通过体外(in vitro)实验检测PTX或DOX暴露的CAFs对肿瘤迁移和侵袭的影响。开展孟德尔随机化(MR)、BayesPrism及scPagwas等生物信息学分析以阐明IL-8+ CAFs在乳腺癌(BRCA)中的临床相关性。此外，进行体外(in vitro)实验确认CAFs来源的IL-8的促肿瘤效应并探索潜在分子机制。结果：研究发现，与未处理CAFs相比，暴露于PTX或DOX的CAFs进一步促进肿瘤迁移和侵袭。值得注意的是，PTX和DOX显著上调CAFs中IL-8的表达水平，表明IL-8可能是介导化疗药物暴露CAFs促肿瘤效应的关键细胞因子。有趣的是，该促肿瘤效应可被IL-8受体抑制剂reparixin部分逆转。MR分析证实IL-8 eQTL及血浆IL-8水平均与乳腺癌风险显著相关。BayesPrism和scPagwas的进一步见解表明IL-8+ CAFs与临床预后相关，并可能在乳腺癌进展中起关键作用。此外，研究人员证实了CAFs来源IL-8的促肿瘤效应。机制上，IL-8可能通过激活NF-κB通路调节凋亡，从而抑制肿瘤细胞凋亡并导致化疗耐药。临床上，高IL-8表达与乳腺癌患者的化疗耐药及生存不良相关。结论：研究表明，PTX或DOX处理后CAFs中IL-8的上调可能促成化疗介导的肿瘤进展。这些发现为改善化疗结局提供了潜在途径。
该研究发表于《Frontiers in Immunology》。目前乳腺癌(BRCA)的新辅助化疗(NAC)在术前、术后及姑息治疗中发挥作用，但化疗耐药导致的复发转移仍是阻碍患者获得长期缓解及治愈的主要障碍。既往关于耐药和转移的研究多聚焦肿瘤细胞内部的遗传改变，而化疗诱导的耐药和转移逐渐成为新热点。化疗在发挥抗肿瘤效应的同时，也诱导肿瘤微环境(TME)产生脱靶效应促进转移，全身给药的细胞毒药物不可避免影响非肿瘤细胞引发宿主反应，TME中肿瘤细胞与非肿瘤细胞动态互作使肿瘤逃逸并促进耐药转移。DNA损伤诱导内皮细胞释放IL-6等、紫杉醇(PTX)诱导巨噬细胞浸润释放组织蛋白酶、铂类激活骨髓间充质干细胞分泌脂肪酸等均被报道参与保护肿瘤抵抗化疗。癌症相关成纤维细胞(CAFs)是TME重要细胞亚群，但化疗药物暴露下CAFs对肿瘤细胞的影响研究较少。因此揭示CAFs在化疗介导肿瘤进展中的潜在机制具有临床相关性，本研究旨在探讨PTX或多柔比星(DOX)暴露的CAFs在肿瘤进展中的作用及机制，提出化疗联合靶向IL-8可能是抑制肿瘤进展的有效策略。
研究人员开展的关键技术方法包括：收集50例NAC治疗期间患者血清及100例NAC前后肿瘤组织样本；原代分离培养CAFs及正常成纤维细胞(NFs)并收集条件培养基(CM)；培养MCF-7、MDA-MB-231细胞及患者来源肿瘤类细胞簇(PTCs)；从GWAS数据库获取IL-8 eQTL及循环IL-8蛋白水平数据，从TCGA获取BRCA生存信息，从GEO下载GSE23399及GSE268662数据集进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析；运用BayesPrism解卷积分析及scPagwas计算各细胞亚群性状相关评分(TRS)；进行CCK-8、伤口愈合、侵袭、集落形成、酶联免疫吸附试验(ELISA)、定量实时PCR(qRT-PCR)、TUNEL、蛋白质印迹(Western blotting)、免疫组织化学(IHC)、H&E染色等实验；建立NSG裸鼠异种移植模型；使用Kaplan-Meier Plotter进行生存分析；采用逆方差加权(IVW)、MR-Egger及Cochran's Q检验进行MR分析；使用SPSS 24.0进行统计检验及Benjamini-Hochberg法校正错误发现率(FDR)。
研究结果如下：
3.1 Chemotherapy-pretreated CAFs exhibit superior pro-tumorigenic capabilities compared to CAFs：研究人员将CAFs暴露于PTX(0.01 μM)或DOX(0.01 μM) 24小时收集CM，通过CCK-8、伤口愈合及侵袭实验检测发现，CAFs的CM可促进MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖、愈合及侵袭，且经PTX或DOX处理的CAFs进一步增强上述效应。
3.2 Chemotherapy promoted IL-8 expression in vitro and in vivo：分析GSE23399数据集发现PTX和DOX上调CAFs中IL-8表达；qPCR和ELISA证实PTX和DOX以剂量和时间依赖方式促进CAFs中IL-8表达；NAC后乳腺癌患者肿瘤间质IL-8表达显著上调且主要定位于α-SMA表达的CAFs；CAFs中IL-8高于肿瘤细胞及NFs，化疗后NFs中IL-8亦升高但低于CAFs。
3.3 IL-8 involved in the enhanced tumor-promoting effect of chemotherapy-pretreated CAFs：使用100 nM Reparixin处理肿瘤细胞后与CAFs共培养，发现Reparixin部分逆转化疗预处理CAFs的促肿瘤效应，表明IL-8在介导该效应中起关键作用。
3.4 Mendelian randomization reveals a causal relationship between IL-8 and BRCA：MR分析显示IL-8 eQTL及血浆IL-8水平均与BRCA风险正相关；留一法分析证实无单SNP偏倚因果推断，MR分析中无异质性和多效性。
3.5 The potential role of IL-8+ CAFs in BRCA：在GSE268662数据集中鉴定Fibroblasts 5为高表达IL-8的IL-8+ CAFs；scPagwas计算TRS显示IL-8+ CAFs与BRCA相关性显著高于IL-8- CAFs；BayesPrism解卷积TCGA-BRCA批量RNA-seq数据并按评分分组，生存分析显示高IL-8+ CAFs组预后更差。
3.6 Effects of CAFs-derived IL-8 on tumor cells：转染IL-8质粒的CAFs促进肿瘤细胞增殖、愈合、侵袭及集落形成；CAFs来源IL-8降低肿瘤细胞对PTX或DOX的化学敏感性；TUNEL显示其减少PTX或DOX诱导的凋亡；在3D培养PTCs模型中同样增强PTCs对PTX和DOX的耐药。
3.7 IL-8 promoted the growth of tumor xenografts：异种移植模型显示IL-8促进肿瘤生长并减少凋亡；H&E染色显示IL-8注射组肿瘤组织恶性程度更高，核深染、细胞异型性增加、排列密集且凋亡组织少。
3.8 The mechanism of IL-8 mediates chemoresistance：研究发现IL-8(100 ng/ml)处理上调肿瘤细胞中磷酸化p65(p-p65)表达，提示激活NF-κB通路，同时抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-2表达增加，促凋亡蛋白Bax减少；加入NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082部分逆转上述变化；异种移植组织IHC显示IL-8注射后p-p65上调；NAC后患者组织IHC显示耐药组Bcl-xL和Bcl-2高表达、Bax低表达，异种移植组织同理；敲低Bcl-xL或Bcl-2后IL-8介导的化疗耐药显著减弱，证实IL-8通过激活NF-κB通路上调Bcl-xL和Bcl-2、下调Bax导致化疗耐药。
3.9 IL-8 associated with chemoresistance and poor prognosis in BRCA patients：分析100例NAC患者临床病理特征发现IL-8表达与化疗敏感性及pTNM分期相关；耐药组肿瘤间质IL-8表达显著高于敏感组；所有患者术后血清IL-8骤降，耐药组血清IL-8升高而敏感组降低；Kaplan-Meier Plotter显示高IL-8表达与接受NAC的BRCA患者低远处转移无复发生存(DMFS)及无复发生存(RFS)相关。
讨论部分总结：研究人员通过多组学和实验揭示化疗诱导CAFs分泌IL-8促进肿瘤进展并损害疗效，PTX和DOX显著上调CAFs中IL-8，高IL-8与预后不良及耐药相关，MR、scPagwas及BayesPrism证实IL-8+ CAFs是关键亚群。在PTCs模型中IL-8降低对PTX或DOX敏感性并抑制凋亡，TUNEL显示其减少化疗诱导凋亡。IL-8通过激活NF-κB通路上调Bcl-xL和Bcl-2、下调Bax导致耐药。IL-8结合CXCR1/2触发PI3K/Akt及NF-κB磷酸化级联，上调抗凋亡蛋白并促进上皮间质转化(EMT)。靶向IL-8具治疗前景，联合化疗与IL-8阻断或可破坏保护性基质微环境增敏肿瘤细胞。研究局限在于聚焦CAFs中IL-8而忽略巨噬等其他细胞，IL-8可能仅部分起作用，异种移植用外源IL-8而非化疗预处理CAFs共注射未能完全反映TME互作，未来需用患者来源预处理CAFs共注射系统还原生理环境。
结论部分翻译：总之，虽然化疗缩小肿瘤体积，但似乎同时诱导CAFs中IL-8表达，驱动肿瘤走向治疗耐药和转移。本研究强调了化疗诱导CAFs分泌IL-8对化疗疗效的潜在反向作用，并提出IL-8可能是癌症治疗的潜在靶点。最终，研究结果为化疗诱导耐药的潜在机制提供见解，表明靶向IL-8可增强化疗疗效。
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