《Frontiers in Immunology》：Fibrotic remodeling in the NOD/ShiLtJ mouse model of Sj?gren’s disease: insights from single-cell transcriptomics and AI-driven ECM quantification
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引言：Sj?gren’s病（SjD）是一种以唾液腺功能减退和淋巴细胞浸润为特征的自身免疫性疾病，但纤维化对腺体功能障碍的贡献仍不明确。方法：研究人员评估了NOD/ShiLtJ小鼠作为唾液腺纤维化模型的适用性，并利用其检验抗纤维化治疗对细胞外基质（ECM）重塑的
引言：Sj?gren’s病（SjD）是一种以唾液腺功能减退和淋巴细胞浸润为特征的自身免疫性疾病，但纤维化对腺体功能障碍的贡献仍不明确。方法：研究人员评估了NOD/ShiLtJ小鼠作为唾液腺纤维化模型的适用性，并利用其检验抗纤维化治疗对细胞外基质（ECM）重塑的影响。为评估治疗潜力，研究人员使用尼达尼布（nintedanib，一种获美国FDA批准用于治疗慢性纤维化性间质性肺病的抗纤维化药物）治疗雌性NOD/ShiLtJ小鼠。采用单细胞RNA测序结合天狼星红染色与利用FibroNest进行的AI辅助数字病理定量分析（针对I型胶原蛋白图谱）对纤维化程度进行了评估。结果：单细胞RNA测序显示，相比对照组小鼠，雌性NOD/ShiLtJ小鼠下颌下腺和舌下唾液腺的成纤维细胞群体表现出ECM基因表达水平的升高，包括Col1a1、Col1a2和Col3a1。与这些转录层面的变化相一致，天狼星红染色结合AI辅助的I型胶原蛋白图谱纤维化定量分析表明，相比对照组，雌性NOD/ShiLtJ小鼠下颌下腺腺泡周围ECM存在显著的纤维化重塑。值得注意的是，纤维化的严重程度与该品系特征的糖尿病表型强相关，且导管周围和腺泡周围纤维化均随年龄增长而进展。为期8周的尼达尼布治疗导致多项纤维化指标的适度但可测量的降低。讨论：总体而言，这些发现确立了NOD/ShiLtJ品系作为SjD相关唾液腺纤维化模型的地位，并提供了概念验证证据，支持将抗纤维化策略作为治疗SjD中唾液腺功能障碍的潜在途径。
研究背景与意义：Sj?gren’s病（SjD）是一种主要发生于绝经后女性的风湿性自身免疫性疾病，会导致慢性的严重干眼和口干症状。这些口干症状归因于唾液腺分泌功能减退，进而引发吞咽困难、龋齿及牙周炎等并发症，严重降低患者的生活质量。尽管SjD的病因复杂，涉及年龄、性别及环境和遗传因素导致的先天和适应性免疫失调，但目前的治疗手段非常有限。虽然该疾病以唾液分泌减少为特征，但其潜在的细胞和分子病理机制尚未完全明确。以往研究多集中于淋巴细胞浸润等炎症指标与腺体功能的负相关，而纤维化（即组织中ECM过度积累）这一特征在SjD中却较少被研究和关注。临床评估中虽已观察到SjD患者唇腺活检样本中存在纤维化且与病灶评分呈正相关，但并未将其列为诊断标准。成纤维细胞在向肌成纤维细胞转化时会驱动异常的ECM沉积与重塑，且SjD患者的腺体成纤维细胞已被证实具有促炎特性，提示其可能是该疾病的潜在驱动因素。为了探究纤维化是否在SjD相关的唾液腺功能减退中发挥因果作用，并验证抗纤维化干预手段的疗效，研究人员开展了此项研究。论文发表在《Frontiers in Immunology》。该研究不仅将NOD/ShiLtJ小鼠确立为研究SjD唾液腺纤维化的有效模型，还为靶向纤维化网络以治疗SjD腺体功能障碍提供了概念验证支持。
关键技术方法：研究人员主要采用了以下关键技术：将NOD/ShiLtJ及CD1小鼠的唾液腺组织进行解离，利用单细胞RNA测序分析细胞亚群及基因表达图谱；采用特异性识别原纤维状胶原的天狼星红染色法对组织切片进行染色，以凸显ECM沉积状况；借助基于云端的AI驱动高分辨率数字病理分析平台FibroNest对PSR染色全切片图像进行量化，将纤维化表型划分为胶原蛋白沉积、纤维形态测定和纤维化结构三个互补分析层，并精细分离了导管周围和腺泡周围区域，计算了140种主要定量纤维化特征，生成表型纤维化复合评分等指标。样本队列来源于University at Albany饲养的雌性NOD/ShiLtJ小鼠与远交系CD1对照小鼠的颌下腺及舌下腺组织。
研究结果：
NOD/ShiLtJ成纤维细胞和巨噬细胞在20周时表现出促炎/促纤维化表型
通过单细胞RNA测序研究，研究人员发现相比CD1对照组，20周龄NOD/ShiLtJ小鼠唾液腺内成纤维细胞表达显著更高水平的特定胶原蛋白、Matrisome调节因子、糖蛋白和蛋白聚糖。此外，巨噬细胞在NOD/ShiLtJ小鼠腺体中同样表现出更高水平的ECM相关mRNA。差异表达基因分析显示，NOD小鼠成纤维细胞中多种与激活促纤维化细胞群体相关的基因（如Fap、Col3a1和Adamts12）表达上调，且在成纤维细胞和巨噬细胞中均检测到Mndal的差异表达。这证实了在NOD/ShiLtJ小鼠中，上述两类细胞处于类似肌成纤维细胞的促纤维化和促炎状态。
NOD/ShiLtJ小鼠唾液腺在20周时表现为纤维化反应
通过对组织切片进行PSR染色及FibroNest平台量化分析，研究人员观察到NOD/ShiLtJ小鼠颌下腺相较CD1对照组存在过量的ECM积累。量化分析显示，在排除了导管周围胶原蛋白后，涵盖微细胶原蛋白、粗大胶原蛋白及复杂结构的140项qFTs指标得分均显著上升，揭示了20周龄NOD小鼠颌下腺中存在间质纤维化。
NOD/ShiLtJ小鼠唾液腺的纤维化反应与高血糖相关
在对纤维化表型进行进一步检验时，研究人员根据血糖值将NOD小鼠细分为糖尿病表型组和非糖尿病表型组。线性回归分析表明，纤维化胶原蛋白复合评分与血糖水平存在显著相关性。进一步比对发现，非糖尿病NOD小鼠的各项FibroNest纤维化评分与对照组相比大多无显著差异；而表现出糖尿病表型的NOD小鼠颌下腺在所有FibroNest纤维化评分中均呈现统计学意义的显著增加。这表明该小鼠的纤维化病程与高血糖及糖尿病表型密切相关。
尼达尼布调节NOD/ShiLtJ小鼠颌下腺的胶原蛋白组装
研究人员借助scRNASeq数据确认了尼达尼布靶标基因在NOD成纤维细胞中的高表达。在明确16周为疾病中期的纤维化起始时间点后，研究人员从16周至24周对小鼠给药。AI量化结果表明，行尼达尼布治疗后的小鼠表型纤维化复合评分与纤维化结构复合评分较载体处理组出现统计学意义的降低。虽然胶原蛋白复合评分及形态测定评分未见显著统计差异，但尼达尼布处理动物在包括组装胶原蛋白分支计数、面积和周长等多项指标上呈现较低数值。这提示尼达尼布能够小幅且可测地减缓纤维化的进展，主要干扰了纤维化网络的组织结构及减少了进行性纤维化中腺泡周围区域的晚期胶原成熟与交联。
讨论与结论：本研究利用基于图像的定量分析表明，雌性NOD/ShiLtJ小鼠在疾病进展中表现出异质性的导管周围和腺泡周围纤维化表型。该纤维化程度与糖尿病表型密切相关，提示在NOD唾液腺中，高血糖可能是纤维化的重要代谢驱动因素。scRNASeq分析揭示NOD小鼠成纤维细胞呈现促炎和促纤维化并存的表型特征。尽管尼达尼布未能完全消除或预防纤维化，但可适度减缓腺泡周围胶原网络的成熟进展，这与其干扰复杂交联的胶原蛋白组装的机制相符。研究人员总结认为，这些发现突出了NOD/ShiLtJ小鼠在SjD纤维化研究中的实用性，并证实了成纤维细胞驱动的纤维化重塑参与了该疾病状态下的腺体病理改变。尽管在本研究中尼达尼布的疗效有限，但针对纤维化网络组织的干预具有可靶向治疗的潜力。当前体局限在于样本规模较小，且未能测得由于测量指标异质性过高而带来的尼达尼布对唾液分泌量的功能性改善。针对SjD中纤维化与炎症间的复杂机制及其相互作用，未来需要更大规模的队列及人类患者样本来进行验证；靶向成纤维细胞与免疫细胞交联信号或最新FDA批准的靶向磷酸二酯酶-4B的新药Nerandomilast等非受体靶向策略及更新型AI数字病理评估手段，将为未来探索抗纤维化手段治疗SjD提供重要的临床前景。
