鼻内递送的溶血性嗜血杆菌引发黏膜免疫细胞启动与对流感及不可分型流感嗜血杆菌的异源保护相关

《Frontiers in Immunology》：Mucosal immune cell priming by intranasally delivered Haemophilus haemolyticus is associated with heterologous protection against influenza and nontypeable Haemophilus influenzae

　　

引言：鼻内疫苗提供了一种无针策略以增强对呼吸道感染的免疫。研究人员调查了一种新型鼻内疫苗的作用机制，该疫苗使用人类呼吸道共生菌溶血性嗜血杆菌（Haemophilus haemolyticus，Hh），先前已显示可保护免受不可分型流感嗜血杆菌（nontypeable Haemophilus influenzae，NTHi）中耳炎并加速清除甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）。方法：通过光谱流式细胞术，在鼻内Hh处理后2-144小时评估小鼠的黏膜和全身细胞免疫应答，并与安慰剂或Toll样受体（Toll-Like Receptor，TLR）2-6激动剂Pam2CSK4进行比较。还评估了治疗对后续IAV和NTHi攻击的影响。结果：Hh诱导了独特的组织特异性免疫特征，快速招募中性粒细胞和炎性单核细胞至肺部，在6小时达到峰值，早于Pam2CSK4。Hh还在48小时内产生了更高比例的鼻腔CD103⁺CD4⁺ T细胞，这些细胞在后续IAV和NTHi感染后进一步扩增。讨论：这些发现表明Hh启动黏膜免疫应答以促进异源保护。

### 论文解读：鼻内递送溶血性嗜血杆菌通过黏膜免疫细胞启动赋予对流感及不可分型流感嗜血杆菌的异源保护

**研究背景与问题**
全球每年约120亿次上呼吸道感染（URTIs），其中病毒性感染占主导，常并发细菌性中耳炎（OM）和肺炎，导致抗生素广泛使用并加速抗菌药物耐药性（AMR）。不可分型流感嗜血杆菌（NTHi）是OM和社区获得性肺炎的主要病原体，缺乏获批疫苗，且其感染常由流感病毒（IAV）等呼吸道病毒触发。现有研究显示，细菌来源的病原体相关分子模式（PAMPs）或活菌制剂可诱导异源免疫保护，但机制尚不明确。溶血性嗜血杆菌（Hh）是人类呼吸道共生菌，与NTHi基因组高度同源（92-94%），先前研究证实鼻内递送Hh可预防IAV驱动的NTHi-OM并加速IAV清除。然而，Hh诱导的细胞免疫动力学特征及其与异源保护的关系尚未阐明。

**研究目的与结论**
研究人员旨在通过小鼠模型，系统解析鼻内递送Hh后呼吸道和全身的细胞免疫应答，并与合成TLR2/6激动剂Pam2CSK4对比，以揭示Hh介导异源保护的机制。结论表明：Hh快速引发先天免疫细胞（中性粒细胞和炎性单核细胞）浸润，并在48小时内促进鼻腔CD103⁺CD4⁺ T细胞扩增，这些细胞在后续IAV和NTHi联合攻击后进一步增加。该研究为开发基于活菌的鼻内疫苗提供了免疫学依据，论文发表在《Frontiers in Immunology》。

**主要技术方法**
研究使用BALB/cJ小鼠（来源：The Kids Research Institute Australia动物核心设施），通过鼻内给药（Hh菌株H19，5×10⁷ CFU；Pam2CSK4 1μg/mL；盐水对照）。光谱流式细胞术（FACSymphony? A5 SE）结合PhenoGraph聚类分析702个组织样本中的52,300,294个CD45⁺白细胞，鉴定16个免疫亚群。qPCR检测Hh分布（靶向hypD基因），NTHi定量培养（壮观霉素巧克力琼脂）。统计采用广义混合效应模型（Beta回归，logit链接）和Benjamini-Hochberg校正。

**研究结果**
**1. 溶血性嗜血杆菌在鼻内递送后迅速从呼吸道组织清除，表明持续定殖并非预防NTHi OM所必需**
通过qPCR检测显示，Hh在鼻组织中24-48小时内清除，肺组织中6-24小时内清除，且未在血液中检出。NTHi定量培养证实，Hh预处理使中耳组织NTHi载量降低141倍，其中3/6小鼠完全检测不到活菌，而盐水对照组均达>1×10⁵ CFU/mL（p=0.04）。

**2. 鼻组织、肺和脾脏的高维光谱流式细胞术鉴定主要免疫细胞亚群**
通过全谱流式细胞术对52,300,294个CD45⁺白细胞进行聚类，获得16个注释亚群，包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、T细胞、NK细胞、B细胞等。主成分分析（PCA）显示各组织稳态免疫组成差异显著。

**3. 鼻内溶血性嗜血杆菌引发吞噬细胞的超急性浸润及后续呼吸组织中淋巴细胞的启动**
Hh处理6小时后，肺中性粒细胞频率达28.8%（中位数），较盐水组高74.1倍，且峰值早于Pam2CSK4（24小时峰值）。炎性单核细胞在Pam2CSK4组最高（4.4%），Hh组次之（2.6%）。B细胞频率在6小时肺组织中下降。48小时，鼻腔CD103⁺CD4⁺ T细胞频率在Hh组（1.5%）和Pam2CSK4组（0.94%）均显著高于盐水组（0.2%）（p<0.0001）。

**4. H. haemolyticus处理的小鼠在IAV感染后鼻腔CD103⁺CD4⁺ T细胞增加，自然杀伤细胞减少**
在IAV攻击后144小时，Hh+IAV组鼻腔CD103⁺CD4⁺ T细胞频率（1.70%）显著高于Saline+IAV组（0.96%）（p=0.02），而Ly6C^- NK细胞频率降低（3.1% vs 5.2%，p=0.04）。Pam2CSK4处理组则下调Ly6C⁺ NK细胞和Ly6C⁺CD8⁺ T细胞。

**5. 宿主对不可分型H. influenzae的免疫应答在免疫学上弱于对H. haemolyticus的应答**
48小时时，Hh处理在鼻腔诱导了CD103⁺CD4⁺ T细胞（7.08倍）、cDC1（2.80倍）等多种细胞上调，而NTHi处理仅引起CD64⁺巨噬细胞（2.84倍）和cDC1（2.80倍）等有限变化，表明NTHi具有免疫逃逸特性。

**6. H. haemolyticus在鼻内NTHi攻击后启动CD4⁺ T细胞**
在IAV-NTHi OM模型中，Hh+IAV+NTHi组鼻腔CD103⁺CD4⁺ T细胞频率（2.20%）显著高于Saline+IAV+NTHi组（1.3%）（p=0.005），而Pam2CSK4处理组未见显著差异。

**讨论与结论**
讨论部分指出，Hh的快速清除表明其保护机制不依赖持续定殖，而是通过早期先天免疫启动（肺中性粒细胞和炎性单核细胞浸润）及后续适应性免疫（鼻腔CD103⁺CD4⁺ T细胞扩增）实现。与合成TLR2/6激动剂Pam2CSK4相比，Hh作为活菌含有多种PAMPs，其免疫应答更为广泛，且可能通过T细胞介导的交叉保护或旁观者保护发挥作用。研究局限性包括无法在同一动物中测量临床和免疫学终点，以及样本量限制无法评估性别差异。结论翻译：本研究强调了Hh刺激异源免疫的能力，涉及先天细胞和T细胞的早期启动，与合成刺激物观察到的不同，类似于减毒活菌鼻内疫苗（如BPZE1）。结合Hh介导的保护作用及重复给药增强疗效的证据，这些发现凸显了由活菌共生菌组成的鼻内疫苗作为无针策略提供广泛保护的潜力，是解决NTHi和呼吸道疾病未满足需求的可行途径。