Pongamia pinnata (L.) Pierre叶提取物：采用体外(in vitro)、体内(in vivo)与计算机模拟(in silico)方法对抗与水传播细菌性病原体相关的腹泻疾病

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Pongamia pinnata (L.) Pierre leaf extract: in vitro, in vivo, and in silico approaches to combat the waterborne bacterial pathogens associated with diarrheal conditions

　　

摘要：Pongamia pinnata (L.) Pierre是一种传统用于印度民族医学的药用植物，研究人员通过结合体外(in vitro)、体内(in vivo)与计算机模拟(in silico)方法评估了其抗腹泻、抗菌及抗氧化特性。本研究旨在探讨植物在传统医学中的应用，并鉴定合适的次级代谢产物以帮助减少生命系统中的细菌生长，从而降低水传播疾病与腹泻的风险。对P. pinnata叶提取物的筛选确认了包括生物碱、黄酮类化合物等各类生物活性成分的存在，且其具有较强的抗氧化活性。体外(in vitro)抗菌试验显示该植物提取物能有效抑制多种水传播病原体，特别是Shigella dysenteriae Castellani and Chalmers, 1919；体内(in vivo)研究亦显示出显著的剂量依赖性抗腹泻效应。高剂量急性口服毒性试验证实了提取物的安全性，对体重、行为或重要器官无不良影响。气相色谱-质谱(GC–MS)分析揭示了多种次级代谢产物，其中N-decanoic acid在植物提取物中含量最为丰富。值得注意的是，1,2,5,6-di-O-isopropylidene-3-O-methanesulfonyl glucofuranose与spiro{2,4}heptane衍生物在与青霉素结合蛋白(PBPs)的分子对接研究中表现出比标准药物氨苄西林(ampicillin)更强的结合亲和力。这些发现表明P. pinnata含有具有显著抗腹泻与抗菌活性的强效代谢产物，为开发针对水传播细菌性病原体的植物源治疗药物提供了前景。实验与计算方法的整合强化了其在未来针对腹泻疾病的药物开发中的候选地位。

研究背景方面，腹泻性疾病是全球范围内常见的细菌感染，据WHO (2004)统计占所有死亡人数的3.2%，是过早死亡和残疾导致生产力损失的第二大原因。尽管经济与医疗取得进展，由于缺乏清洁饮用水，腹泻预计到2020年仍是主要健康问题。受污染水体中的大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhi)等细菌可引起霍乱、痢疾、伤寒及胃肠道症状。药用植物产生的生物活性分子作为天然药物对药物开发至关重要，印度丰富的生物多样性提供了多种传统药用植物资源。Pongamia pinnata (L.) Pierre隶属豆科(Fabaceae)，俗称Karanja、Indian beech或Pongam，其不同部位在传统医学中用于治疗支气管炎、咳嗽、风湿病、糖尿病及腹泻等。然而，针对其叶提取物对抗水传播致腹泻病原体的综合体外(in vitro)、体内(in vivo)与计算机模拟(in silico)研究尚待系统验证。因此，研究人员开展此项整合实验与计算的研究，以验证其民族药用价值并探究其基于青霉素结合蛋白(PBPs)的抗菌机制，论文发表于《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：植物材料采集自印度北方邦Prayagraj的Teliarganj，制备甲醇提取物并进行次级代谢产物定性筛选；采用DPPH与超氧化物自由基清除法评估抗氧化活性；采用纸片扩散法与肉汤微量稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)进行体外(in vitro)抗菌调查；使用瑞士白化小鼠进行急性口服毒性试验（OECD Guideline 425）与蓖麻油诱导腹泻模型评估体内(in vivo)抗腹泻活性；利用气相色谱-质谱(GC–MS)分析次级代谢产物组成；通过AutoDock Vina进行计算机模拟(in silico)分子对接靶向青霉素结合蛋白(PBPs)，并利用GROMACS 2022进行100 ns分子动力学(MD)模拟评估结合稳定性；采用Swiss ADME工具进行吸收、分布、代谢和排泄(ADME)与类药性预测；利用STRING与Cytoscape进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络与功能富集分析。

研究结果部分保留小标题说明如下：

次级代谢产物筛选结果显示，P. pinnata叶甲醇提取物中含有生物碱、黄酮类、强心苷、皂苷、类固醇、鞣质、萜类化合物及固定油和脂肪，不含蛋白质、氨基酸、还原糖及蒽醌。

抗氧化活性研究显示，该植物叶甲醇提取物对DPPH自由基具有较强清除能力，呈浓度依赖性，IC₅₀为281.71，标准抗坏血酸为249.88；超氧化物清除IC₅₀为317.59，标准芦丁为253.25；并表现出浓度依赖性的还原能力。

抗菌活性研究表明，叶甲醇提取物对不同浓度的人致病细菌表现出不同程度的抑制，最高浓度100 mg/mL抑制圈最大，对痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)抑制圈显著（21 ± 0.76），对霍乱弧菌(Vibrio cholerae)最低（14 ± 1.9）。MIC与MBC分别为0.625至5 mg/mL，对S. dysenteriae效力最强（MIC 0.625，MBC 1.25），效力排序为S. dysenteriae > S. typhimurium > E. coli > K. pneumoniae > V. cholerae。

急性毒性试验表明，单次2000 mg/kg体重剂量下无死亡或毒性迹象，LD₅₀大于2000 mg/kg，14天内对照组与处理组在体重及相对器官重量（肺、肝、肾、脾）上无显著差异。

植物提取物对蓖麻油诱导腹泻的影响显示，各剂量组均显著减少排便频率，600 mg/kg剂量下总排便抑制率达55.14%，腹泻粪便抑制率达53.98%，与阴性对照相比具显著性差异（P < 0.05）。

组织病理学研究显示，所有结肠组织学切片显示健康正常架构，未见显著病理效应，可能与短期（1天）诱导有关。

GC–MS分析鉴定出22种次级代谢产物，主导化合物为N-decanoic acid（面积% 27.697）、4-N-hexylthiane（87.19%Norm）与neophytadiene（20.67%Norm），并包含1,2,5,6-Di-O-isopropylidene-3-O-methanesulfonyl glucofuranose与spiro{2,4}heptane等衍生物。

计算机模拟(in silico) ADME预测显示多数化合物符合利平斯基五规则(Lipinski's Rule of Five)，分子量(MW) <500 Da，氢键供体(HBD) <5，氢键受体(HBA) <10，LogP <5，拓扑极性表面积(TPSA) <140，具良好水溶性及膜通透性潜力。

细菌蛋白受体识别选定青霉素结合蛋白(PBPs)作为靶标，因其参与细胞壁合成且与氨苄西林作用机制相关。

分子对接与相互作用分析表明，flutriafol（-8.1 kcal/mol）、1,2,5,6-Di-O-isopropylidene-3-O-methanesulfonyl glucofuranose（-6.7 kcal/mol）及spiro{2,4}heptane（-6.6 kcal/mol）的结合亲和力优于标准药氨苄西林（-6.3 kcal/mol），并通过氢键与疏水相互作用锚定于PBPs活性口袋。

蛋白质-蛋白质相互作用与受体蛋白功能分析通过STRING构建含21节点106边的网络，核心基因包括yaih、dacB、dacC、dacA、mrcB、mrdA、ftsl、mrdB、c3045、yfhM，涉及肽聚糖生物合成过程、细胞形状调节及细胞壁组织。

GO功能与KEGG通路富集分析显示共1396个GO条目，显著生物过程(BP)为肽聚糖生物合成过程(GO:0009252)、细胞形状调节(GO:0008360)等；分子功能(MF)主要为羧肽酶活性(GO:0004180)与青霉素结合(GO:0008658)；KEGG显著富集肽聚糖生物合成(ecc00550)与β-内酰胺耐药(ecc01501)通路。

蛋白质-配体复合物结合稳定性评估通过100 ns分子动力学(MD)模拟，以均方根偏差(RMSD)、均方根波动(RMSF)、回转半径(Rg)、溶剂可及表面积(SASA)、氢键(H-bond)及主成分分析(PCA)衡量。结果显示flutriafol与PBPs复合物结构更稳定，RMSD约2 ?，氢键数最终稳定在7个，优于其他配体及氨苄西林的动态波动。

讨论部分总结指出，药用植物是潜在化疗药物的宝库，P. pinnata含有的生物碱、酚类与萜类具治疗意义，其抗氧化活性与高黄酮含量相关。甲醇提取物对革兰氏阴性菌的抑制差异源于外膜屏障，MIC与MBC值较低表明强抗菌活性。急性毒性试验符合OECD 423指南类别5低毒范畴。蓖麻油诱导腹泻模型反映分泌与运动相关腹泻，提取物可能通过抗分泌与抗运动作用抑制前列腺素介导的分泌。GC–MS中N-decanoic acid丰度最高，neophytadiene具多重药理属性。计算机模拟(in silico)中flutriafol、1,2,5,6-Di-O-isopropylidene-3-O-methanesulfonyl glucofuranose与spiro{2,4}heptane结合力优于氨苄西林，分子动力学(MD)证实flutriafol稳定性最高。局限在于粗提物可能存在假阳性，GC–MS对非挥发性成分检测有限需LC–MS补充，体内(in vivo)模型未完全模拟感染性腹泻且缺乏慢性毒理与药代动力学研究。

结论部分翻译：本研究结果强调了P. pinnata叶提取物对细菌性病原体的强抑制活性、在小鼠中的抗腹泻活性及其抗氧化有效性。这种强生物活性归因于显著的生物活性化合物如neophytadiene、N-decanoic acid、1,2,5,6-di-O-isopropylidene-3-O-methane sulfonyl glucofuranose及spiro{2,4}heptane, 1,2,4,5-tetramethyl-6-methylene的存在，它们通过抑制青霉素结合蛋白(PBPs)活性来调节细胞壁与细胞膜的生物合成。分子对接与分子动力学(MD)模拟的整合提升了研究人员对药物-蛋白质相互作用、结合机制及这些复合物动态复杂性的理解。因此，P. pinnata的药理学探索作为管理与水传播细菌性病原体相关腹泻的资源具有潜力。未来聚焦化合物分离、毒性分析、药代动力学、制剂开发与临床验证的研究，对于将这些发现转化为安全有效的治疗应用是必要的。