CCL20-CCR6轴介导黏膜相关恒定T细胞-M2巨噬细胞交互作用驱动肝硬化免疫失调

《Frontiers in Immunology》：CCL20-CCR6 axis mediates mucosal-associated invariant T-M2 macrophage crosstalk to drive immune dysregulation in liver cirrhosis

　　

引言：肝硬化是慢性肝病的终末期，以进行性肝纤维化和持续性免疫失调为特征，但免疫细胞交互作用驱动疾病进展的机制仍不清楚。方法：在本研究中，研究人员整合了批量（bulk）和单细胞转录组分析（single-cell transcriptomic analysis）与免疫荧光验证，以探究在肝硬化进展过程中CCL20-CCR6轴在黏膜相关恒定T细胞（MAIT细胞）与巨噬细胞相互作用中的角色。结果：研究人员鉴定出8个核心肝硬化相关免疫基因（OGN、IL32、CCL19、PDGFA、CCL20、NTS、SEMA3C、HSPA2），其中CCL20在黏膜相关恒定T细胞（MAIT）中选择性富集，并与其激活和耗竭相关转录谱紧密关联。细胞间通讯分析（cell-cell communication analysis）揭示，CCL20-CCR6轴可能特异性介导MAIT细胞与M2巨噬细胞之间的双向相互作用，在肝硬化微环境中形成疾病特异性正反馈环路。免疫荧光染色进一步证实了CCL20、MAIT细胞和M2巨噬细胞在肝硬化组织中的富集和共定位。讨论：综上所述，这些发现支持CCL20-CCR6轴作为肝硬化肝免疫失调和纤维化进展的关键调控因子，凸显其作为疾病活动性生物标志物和肝硬化干预治疗靶点的潜力。

**论文解读：CCL20-CCR6轴介导MAIT细胞与M2巨噬细胞交互驱动肝硬化免疫失调**

**研究背景与问题**

肝硬化是多种慢性肝病（如病毒感染、代谢紊乱、酒精滥用或胆汁淤积性损伤）的终末期，以进行性肝纤维化、血管重塑和最终肝功能衰竭为特征，全球每年导致超过100万人死亡。其发病机制涉及细胞外基质（ECM）过度沉积、肝星状细胞（HSC）持续激活以及肝脏微环境显著重塑，伴随持续性炎症和免疫失调。尽管病因多样，免疫失调被认为是肝硬化发生和进展的核心机制，其中先天性和适应性免疫细胞之间的相互作用协同调控纤维生成和肝功能障碍。近年来，研究聚焦于肝硬化中免疫细胞的通讯、浸润和免疫代谢重编程，但免疫细胞交互作用如何驱动疾病进展的具体机制仍未完全阐明。特别是，黏膜相关恒定T细胞（MAIT）作为肝脏中相对富集的非典型T细胞群体，在肝病中表现出频率和功能改变，可能通过分泌促炎细胞因子、调节巨噬细胞/单核细胞表型和促进HSC激活参与肝硬化纤维化进展。然而，MAIT细胞是否通过CCL20-CCR6轴与其他肝免疫亚群进行互作，以及该轴在纤维化中的机械调控，尚缺乏系统阐明。因此，研究人员开展了本研究，旨在通过整合多组学分析揭示CCL20-CCR6轴在MAIT细胞与巨噬细胞交互中的作用，为肝硬化免疫干预提供新靶点。

**研究内容与结论**

研究人员整合了来自基因表达综合数据库（GEO）的批量转录组数据集（GSE49541、GSE164760、GSE14323）和单细胞RNA测序数据（GSE181483），结合免疫荧光与免疫组化验证，系统探究了肝硬化进展中免疫细胞互作机制。通过差异表达分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和最小绝对收缩与选择算子（LASSO）回归，鉴定出8个核心肝硬化相关免疫基因（OGN、IL32、CCL19、PDGFA、CCL20、NTS、SEMA3C、HSPA2），其中CCL20在MAIT细胞中特异性富集，并与激活和耗竭相关转录谱紧密关联。单细胞转录组分析进一步揭示，CCL20-CCR6轴可能特异性介导MAIT细胞与M2巨噬细胞之间的双向交互，在肝硬化微环境中形成疾病特异性正反馈环路。免疫荧光染色证实了CCL20、MAIT细胞和M2巨噬细胞在肝硬化组织中的富集和共定位。这些发现表明CCL20-CCR6轴是肝硬化肝免疫失调和纤维化进展的关键调控因子，具有作为疾病活动性生物标志物和干预治疗靶点的潜力。论文发表在《Frontiers in Immunology》。

**主要关键技术方法**

研究人员利用公开的转录组数据集：GSE49541（含40例轻度肝纤维化样本和32例肝硬化样本）和GSE164760、GSE14323（合并后经批次校正，含健康对照和肝硬化样本）进行批量分析。采用差异表达分析、WGCNA和LASSO回归筛选核心基因。单细胞转录组分析（GSE181483，含健康和肝硬化样本）中，使用Seurat包进行细胞聚类和注释，CellChat包分析细胞间通讯，Monocle包进行伪时间轨迹分析，scTenifoldKnk进行虚拟基因敲除。免疫荧光染色采用TSA多重标记法，对正常人肝组织以及纤维化、肝硬化样本进行验证，样本来自浙江中医药大学附属第二医院伦理委员会批准。

**研究结果**

**3.1 表型相关基因模块的鉴定**
通过差异表达分析（GSE49541，轻度纤维化 vs 肝硬化），鉴定出642个差异表达基因（DEGs），其中379个上调、263个下调。WGCNA分析（GSE164760和GSE14323合并数据集）识别出10个共表达模块，其中MEblue和MEbrown模块与肝硬化表型显著相关（|r| ≥ 0.7，校正P < 0.05），提示这些模块可能介导肝硬化进展中的关键生物学功能。

**3.2 通过机器学习鉴定核心基因集**
将上调DEGs、MEblue模块基因和免疫相关基因（ImmPort数据库）交叉，得到24个候选基因；下调DEGs与MEbrown模块及免疫基因交叉得到1个候选基因。LASSO回归（10折交叉验证）筛选出17个核心基因，模型在训练集（AUC = 0.96）和外部验证集（AUC = 0.85）均表现优异。最终构建包含8个正系数基因（OGN、IL32、CCL19、PDGFA、CCL20、NTS、SEMA3C、HSPA2）的LASSO基因特征，单样本基因集富集分析（ssGSEA）显示肝硬化组免疫活性评分显著高于对照组（P < 0.0001）。

**3.3 多重免疫浸润分析揭示肝硬化免疫微环境特征**
使用CIBERSORT和ssGSEA（28种免疫细胞特征基因集）分析免疫浸润。肝硬化组中，活化CD4⁺ T细胞、γδT细胞、髓源性抑制细胞、1型辅助T细胞、自然杀伤T细胞、中央记忆CD4⁺ T细胞、效应记忆CD8⁺ T细胞、活化CD8⁺ T细胞、浆细胞样树突状细胞、2型辅助T细胞、肥大细胞和活化B细胞的ssGSEA评分显著升高。LASSO基因特征评分与多种免疫细胞评分呈正相关。免疫荧光染色证实肝硬化组织中巨噬细胞（F4/80）增多、CD8⁺ T细胞激活（CTLA-4上调）和穿孔素表达增加。这些结果提示肝硬化进展与免疫微环境重塑，特别是CD8⁺ T细胞激活密切相关。

**3.4 单细胞转录组分析验证CD8⁺ T细胞在肝硬化中的核心作用**
单细胞RNA测序（GSE181483）分析显示，20个细胞簇中，免疫细胞被保留。LASSO特征ssGSEA评分在肝硬化CD8⁺ T细胞、单核细胞来源巨噬细胞（MoMFs）和1型树突状细胞（DC1）中显著升高。CD8⁺ T细胞高评分组差异表达基因富集于免疫相关GO过程（如单核细胞分化、淋巴细胞分化、肿瘤坏死因子应答）和KEGG通路（如NF-κB信号通路、凋亡、细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号通路、IL-17信号通路），表明CD8⁺ T细胞激活与广泛的免疫激活网络相关。

**3.5 伪时间分析确定CCL20为关键免疫基因，MAIT细胞为目标亚群**
CD8⁺ T细胞亚群（中央记忆CD8⁺ T细胞、效应CD8⁺ T细胞、耗竭CD8⁺ T细胞、MAIT细胞）的伪时间轨迹分析显示，CCL20在MAIT细胞中特异性表达，且肝硬化MAIT细胞中CCL20表达显著高于健康对照。高CCL20表达的MAIT细胞具有更高的细胞毒性、祖细胞耗竭和终末耗竭评分（P < 0.0001），提示CCL20与MAIT细胞功能状态转变相关。组织学验证（Masson染色、Arg1、AFP和CCL20免疫组化）证实肝硬化组织中胶原沉积、M2巨噬细胞积累和CCL20蛋白水平升高。

**3.6 细胞间通讯分析揭示肝硬化特异性CCL20-CCR6轴与MAIT-M2巨噬细胞交互及正反馈调控**
CellChat分析显示，MAIT细胞与MoMFs之间存在强交互，且仅CCL20-CCR6轴具有统计学显著性和特异性。MAIT细胞可通过自分泌CCL20进行自我调节，MoMFs（特别是M2亚型）通过旁分泌CCL20调控MAIT细胞。在肝硬化中，M2巨噬细胞与MAIT细胞之间的CCL20-CCR6双向通讯显著增强，形成正反馈环路，而健康肝中几乎不存在。虚拟敲除CCL20后，MAIT细胞中NFKBIA（NF-κB负反馈调节因子）上调，同时激活相关分子（CD69、CD160）和次级炎症趋化因子（CCL4、CCL5、CCL3L3）上调，功能模块富集于趋化因子介导的炎症招募、TCR/NK样激活和NF-κB信号。

**3.7 免疫荧光验证肝硬化特异性CCL20-CCR6轴介导MAIT-M2巨噬细胞相互作用**
免疫荧光染色（正常、纤维化、肝硬化肝组织）显示，CD161（MAIT细胞标志物）、CCL20、CD206/CD163（M2巨噬细胞标志物）和α-SMA（活化HSC标志物）的共表达荧光强度随疾病进展递增。共定位分析证实CCL20与CD161以及CCL20与CD206/CD163在肝硬化组织中显著重叠，且CD161与α-SMA在纤维化间隔中接近，为MAIT细胞与M2巨噬细胞通过CCL20-CCR6轴形成局部交互单元提供了组织学证据。

**讨论与结论**

**讨论总结**
本研究通过整合批量与单细胞转录组数据，提出了一个新型免疫调控模型：在肝硬化条件下，MAIT细胞与M2巨噬细胞通过CCL20-CCR6轴建立强交互网络。MAIT细胞不仅通过自身CCL20表达实现自分泌调控，还响应M2巨噬细胞分泌的CCL20。这种互作在健康肝中可忽略，在肝硬化微环境中显著增强，形成疾病特异性正反馈环路。CCL20在MAIT细胞中沿伪时间动态增加，高表达与细胞毒性、耗竭表型相关，提示CCL20可能通过NF-κB依赖信号维持MAIT细胞持续低度激活并逐步推向耗竭状态。M2巨噬细胞作为免疫枢纽，通过CCL20-CCR6轴主动招募MAIT细胞，而MAIT细胞反过来上调CCL20，形成局部正反馈，放大炎症、维持HSC激活并促进ECM沉积。临床意义上，CCL20水平可作为肝硬化活动性和进展风险的生物标志物，靶向CCL20-CCR6轴（如中和抗体或CCR6拮抗剂）在临床前研究中显示出抗纤维化效果。本研究也存在局限性：主要基于公开数据集和计算推断，缺乏体外细胞实验和体内动物模型验证，且MAIT细胞耗竭和巨噬细胞极化的动态调控机制未完全阐明。未来需结合空间CITE-seq、Perturb-DBiT和空间三组学测序等前沿技术进一步验证。

**研究结论翻译**
本研究揭示了肝硬化免疫失调的一个关键特征：CCL20-CCR6轴与MAIT细胞和M2巨噬细胞之间的致病性交互作用相关。M2来源的CCL20可能结合MAIT细胞上的CCR6，这与其向更高细胞毒性和耗竭的转录谱转变相关。该过程通过MAIT细胞中的自分泌CCL20环路得到加强，与肝内炎症放大相关，并可能促进纤维化进展。因此，CCL20-CCR6轴成为肝硬化免疫重塑的特异性标志物和潜在治疗靶点，CCL20水平也值得考虑作为疾病活动性的生物标志物。