《Frontiers in Immunology》：Priming of human monocytes by β-glucan and obesity-associated factors: modifications to global DNA methylation, gene expression, phenotype and function
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摘要
引言：单核细胞在调节对外源性和内源性挑战的免疫反应中发挥关键作用。近期研究表明，外源性刺激可诱导单核细胞的代谢、表观遗传和表型变化，从而对其进行重编程或“启动”，使其对后续刺激产生改变的反应。肥胖与免疫功能障碍相关。然而，与肥胖相关的内源性化合物启动
摘要
引言：单核细胞在调节对外源性和内源性挑战的免疫反应中发挥关键作用。近期研究表明，外源性刺激可诱导单核细胞的代谢、表观遗传和表型变化，从而对其进行重编程或“启动”，使其对后续刺激产生改变的反应。肥胖与免疫功能障碍相关。然而，与肥胖相关的内源性化合物启动人单核细胞进而调节后续反应的能力仍有待研究。
方法与结果：本研究使用了来自非肥胖男性的单核细胞。暴露于主要外源性刺激（β-葡聚糖（β-glucan））而非内源性刺激（氧化低密度脂蛋白（oxLDL）、瘦素（leptin）、17β-雌二醇（17β-estradiol））的单核细胞，在应对SK-MEL-28黑色素瘤细胞时表现出改变的表型（CD11b、PD-L1表达增加）。相比之下，经oxLDL启动而非β-glucan启动的单核细胞，在应对佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）的二次刺激时表现出超氧化物产生速率增加，并在应对脂多糖（LPS）的二次刺激时基质金属蛋白酶9（MMP9）活性增强。对未启动单核细胞及经17β-estradiol或oxLDL启动的单核细胞进行的批量RNA测序（bulk RNAseq）分析还显示，与免疫功能、代谢和蛋白质修饰相关的基因存在持续差异表达。此外，质谱分析（mass spectrometry）表明，经β-glucan或oxLDL启动的单核细胞表现出全局DNA甲基化（global DNA methylation）的持续修饰。
结论：这些结果为理解肥胖相关因子导致单核细胞重编程的功能后果及其调控的潜在通路提供了初步步骤。
**论文解读：β-葡聚糖与肥胖相关因子对人单核细胞的启动效应——全局DNA甲基化、基因表达、表型与功能修饰**
**研究背景与问题**
单核细胞在免疫调节中扮演核心角色，其对外源和内源刺激的反应可通过代谢和表观遗传重编程发生长期改变，这一现象称为“先天启动”（innate priming）。既往研究证实，外源性化合物如β-葡聚糖（β-glucan）可增强单核细胞对二次刺激的功能反应，甚至在小鼠模型中改善肿瘤转移控制。然而，肥胖常伴随免疫功能障碍及癌症、感染等疾病风险升高，其相关的代谢和激素变化（如氧化低密度脂蛋白（oxLDL）、瘦素（leptin）、17β-雌二醇（17β-estradiol）水平升高）是否也能诱导单核细胞启动，进而调节后续免疫应答，尚不明确。本研究旨在比较外源性经典启动剂β-glucan与肥胖相关内源性因子（oxLDL、leptin、17β-estradiol）对单核细胞的启动效应，探究其在表型、功能、转录组及全局DNA甲基化层面的修饰，为理解肥胖相关免疫失调机制提供依据。该论文发表在《Frontiers in Immunology》。
**主要关键技术方法**
研究人员从非肥胖男性志愿者（经BMI、腰臀比和体脂率筛选）采集外周血，分离外周血单核细胞（PBMC）后通过贴壁法获取单核细胞。将单核细胞分别与培养基（对照）、β-glucan（5 μg/mL）、17β-estradiol（330 pg/mL）、leptin（100 ng/mL）或oxLDL（10 μg/mL）共孵育24小时进行启动，随后更换培养基静息5天（第3天换液）。第6天进行二次刺激：使用脂多糖（LPS，25 ng/mL）或SK-MEL-28黑色素瘤细胞（间接共培养，0.4 μm Transwell）再刺激24小时。通过流式细胞术检测表面标志物（CD11b、PD-L1等），使用细胞色素C还原法测定超氧化物产生速率，明胶酶谱法检测MMP9活性，批量RNA测序（bulk RNAseq）分析差异表达基因（DEG），质谱法测定全局脱氧胞苷、5-甲基胞苷（5mC）和5-羟甲基胞苷（5hmC）水平以评估DNA甲基化修饰。
**研究结果**
**1. 启动增加单核细胞对SK-MEL-28黑色素瘤细胞二次刺激后的表面标志物表达**
通过流式细胞术，研究人员发现β-glucan启动的单核细胞在二次LPS刺激后细胞数量及TLR4表达增加，与既往研究一致。进一步用黑色素瘤细胞二次刺激后，β-glucan启动组CD11b和PD-L1表达显著高于未启动组（n=3）；而内源性因子（17β-estradiol、leptin、oxLDL）启动未引起表面标志物显著变化。
**2. OxLDL启动增强单核细胞的超氧化物产生和MMP9活性**
通过细胞色素C还原法，oxLDL启动的单核细胞在PMA二次刺激后超氧化物产生速率从0.045 μM/min/10,000细胞升至0.068 μM/min/10,000细胞（P<0.05），而β-glucan、17β-estradiol、leptin启动无显著变化。明胶酶谱法显示，oxLDL启动组在LPS二次刺激后MMP9活性（明胶降解）显著增强，其他启动剂无显著效应。
**3. 启动的单核细胞保留转录组变化**
批量RNAseq分析（各10个独立供体）显示：17β-estradiol启动组与对照相比有7个差异表达基因（3个上调：HES2、KALRN、RN7SL3；4个下调：SLC1A2、PROC、SLC5A3、BISPR），涉及蛋白质修饰、免疫功能和氨基酸代谢通路。leptin启动组无显著差异表达基因。oxLDL启动组有33个差异表达基因（26个上调、7个下调），包括与代谢、免疫应答、蛋白质转运和修饰相关的基因（如HPSE上调）。两个基因（KALRN和RN7SL3）在17β-estradiol和oxLDL启动组中均上调。
**4. 启动单核细胞改变全局DNA甲基化**
质谱分析显示：oxLDL启动组脱氧胞苷水平显著降低，5mC水平显著升高；β-glucan启动组5hmC水平显著降低。17β-estradiol和leptin启动组未观察到显著变化。
**讨论与结论**
研究证实β-glucan启动可上调单核细胞对黑色素瘤细胞的CD11b和PD-L1表达，提示可能促进抗肿瘤表型，但PD-L1的功能具有情境依赖性，需进一步研究。oxLDL启动增强超氧化物产生和MMP9活性，可能与NADPH氧化酶组装及MMP9 mRNA稳定性增加有关，且超氧化物可能通过NOX4诱导的线粒体ROS发挥作用。转录组分析揭示了17β-estradiol和oxLDL启动后持续存在的差异表达基因，涉及代谢、免疫和蛋白质运输等通路，其中KALRN和RN7SL3的上调可能支持启动细胞的增殖、迁移和蛋白质合成。全局DNA甲基化改变（oxLDL增加5mC、β-glucan降低5hmC）直接证明了内源性启动通过表观遗传机制调控单核细胞功能。leptin未观察到显著效应，可能与剂量或实验条件差异有关。研究局限性包括使用胎牛血清、批量RNA测序掩盖细胞异质性、部分实验重复次数有限（n=3）以及仅纳入非肥胖男性。未来需在临床相关人群中验证，并采用靶向技术（如CHIP-甲基化芯片）鉴定特定CpG位点的甲基化变化。
**研究结论翻译**：本研究的这些结果首次证明了肥胖相关内源性因子oxLDL和17β-estradiol能够启动人单核细胞，导致其对二次刺激的表型与功能反应发生改变。转录组分析显示，经17β-estradiol和oxLDL启动的单核细胞与未处理单核细胞相比存在差异基因表达，涉及代谢、蛋白质调节和免疫应答相关通路。一项关键发现是，oxLDL启动的单核细胞表现出改变的全局DNA甲基化，为DNA甲基化作为人单核细胞内源性启动的机制提供了直接证据。综上所述，本研究结果表明，肥胖相关内源性化合物17β-estradiol和oxLDL能够启动人单核细胞，从而产生修饰后的表型和对二次挑战的功能反应。
