SARS-CoV-2刺突蛋白CD4+ T细胞表位优势中的构象偏向

《Frontiers in Immunology》：Conformational bias in SARS-CoV-2 Spike CD4+ T-cell epitope dominance

　　

引言：表位特异性T细胞提供由适应性免疫赋予的对SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike）的显著长效保护。由非ATP依赖性抗原加工蛋白酶产生的CD4+ T细胞表位肽以内体-溶酶体中的适度特异性与主要组织相容性复合体II类（MHC class II）分子结合。研究记录了抗原呈递细胞类型、内吞方式和抗原构象对CD4+ T细胞应答强度的影响。然而，很少有研究报道由于抗原暴露环境导致的表位优势变化，这可能塑造II类途径中的蛋白水解抗原加工，因为构象域限制了蛋白水解或MHCII结合。 方法：研究人员使用可溶性刺突三聚体的有限蛋白水解模拟SARS-CoV-2刺突蛋白的加工，并使用IL-2 Elispot分析响应来自刺突构象稳定和构象不稳定区域的两个九肽池的应答，分析刺突构象对CD4+ T细胞表位优势的影响。 结果：蛋白酶敏感位点与结构域边界和其他构象不稳定区域重合，证实结构限制蛋白水解。两个非住院人类受试者队列中稳定和不稳定肽池的CD4+ T细胞应答比率区分了暴露是通过感染还是疫苗接种。 讨论：暴露于刺突蛋白的环境，例如刺突mRNA疫苗接种或SARS-CoV-2感染，可能影响抗原呈递细胞群体及其活化水平，导致刺突碎片化的不同模式、肽装载和T细胞应答。暴露环境也影响有助于不同优势模式的刺突构象变化。因此，表位优势模式潜在地指示暴露史、免疫印记以及CD4+ T细胞应答的保护性。

该研究发表于《Frontiers in Immunology》。研究背景方面，SARS-CoV-2引起的COVID-19疾病促使研究人员持续审视针对该病原体的免疫反应。作为适应性免疫的主要分支，CD4⁺ T细胞因其在正负向角色中的潜力受到广泛关注。CD4⁺ T细胞通常促进生发中心内的抗体类别转换重组与亲和力成熟，这在COVID-19感染期间的上呼吸道中尤为显著。除辅助抗体外，CD4⁺ T细胞还促进CD8⁺ T细胞发育、招募吞噬细胞、激活先天免疫细胞防御并传递减轻免疫病理的调节信号，这些均被认为与COVID-19恢复相关。测量SARS-CoV-2特异性CD4⁺ T细胞扩增受限于依赖宿主历史和遗传学的异质细胞表型及不同组织归巢。I型干扰素触发微弱或被抑制可能是疾病严重性的重要决定因素，但连接信号通路与组织损伤的免疫细胞网络仍不明确。使用病毒刺突蛋白的疫苗提供了快速且显著有效的重症防护，尽管中和抗体衰减迅速，可能源于骨髓中缺乏长寿浆细胞。更持久的保护可能继续由CD4⁺ 和CD8⁺ T细胞提供。动物模型提供了关键信息，但人类免疫系统的多样性及病毒、疫苗和其他交叉反应实体暴露史的变异性潜在阻碍了基于T细胞的疫苗与治疗的发展。

CD4⁺ T细胞表位优势指的是用完整抗原致敏后对少数可能表位的强或频繁应答。通常12至20个残基的肽显示在II类MHC蛋白（MHCII）中以供T细胞上识别alpha/beta受体，后者也表达结合MHCII不同域的CD4分子。抗原特异性T细胞应答通过特异性T细胞频率量化，其中特异性由合成肽重新刺激细胞确立以模拟天然加工肽。在多CD4⁺ T细胞表位筛查中，读数通常通过表达炎性细胞因子（如IFNγ或IL-2）的细胞形成Elispot，或通过表达炎性细胞因子或活化诱导标记（如CD137和OX40）的流式细胞术，或通过定量TCR克隆或测序进行。天然加工的CD4⁺ 表位通常作为共享8至9个残基决定簇核心序列的重叠肽家族出现。大部分核心包裹在MHCII内并通过与肽骨架的氢键固定，3至4个肽侧链与MHCII沟槽中的浅袋形成有利接触。T细胞受体（TCR）结合MHCII-肽复合物，通常与肽的3至4个朝外侧链接触。显性CD4⁺ 表位常出现在由不同MHCII等位型呈递或同一MHCII使用不同结合寄存器呈递的重叠和邻近序列聚类中。对于包括HIV包膜糖蛋白和流感血凝素在内的多种抗原，这种显性CD4⁺ 表位的聚类归因于蛋白水解抗原加工的优先途径。这些观察导致了基于抗原加工可能性（APL）的CD4⁺ 表位预测机制模型和生物信息学方法，其中构象不稳定的抗原段优先被切割，然后相邻序列被MHCII蛋白结合。

SARS-CoV-2刺突糖蛋白的复杂结构和构象行为有可能调节其II类途径蛋白水解加工和CD4⁺ 表位优势。三聚体SARS-CoV-2刺突糖蛋白的特征在于通过域连接器连接多个结构域以明确构象状态。作为I型融合蛋白，低pH触发融合肽暴露介导病毒基因组转入细胞质。对于SARS-CoV-2刺突，需要两个蛋白水解步骤。刺突（S）切割为S1和S2链启动S2弹簧加载机制，然后在S2'位点切割暴露相邻融合肽。S2'位点的切割在被受体结合域向上旋转以结合靶细胞上的ACE2受体之前被阻断，这作为通过S1亚域1和2介导的构象信号。这些构象特征可能影响刺突CD4⁺ 表位优势。流感A血凝素HA1域中的CD4⁺ 表位优势归因于由抗原加工塑造的肽丰度，且已显示HA2的构象变化影响蛋白质重新刺激特异性T细胞的能力。

本研究的理论基础是COVID-19严重性可能与CD4⁺ 表位免疫优势相关。严重疾病可能源于缺乏保护性CD4⁺ T细胞应答的病毒发病机理，或源于过量或错误导向的CD4⁺ T细胞应答引起的免疫病理。在这两种情况下，CD4⁺ 表位特异性T细胞差异致敏或回忆的直接原因可能是抗原暴露环境的变异，如抗原剂量、平台、佐剂、年龄和预先存在的交叉反应免疫。这些环境导致差异CD4⁺ 表位呈递的方式包括抗原构象、抗原呈递细胞类型和内体酸化程度的变异。此外，人类白细胞抗原（HLA）遗传学和表达不可避免地与此变异相互作用。尽管许多研究报道了HLA等位基因与COVID-19保护或易感性的关联，但极少在最大GWAS工作中得到确认。最显著的是DQB1 * 06与疫苗诱导的抗SARS-CoV-2刺突抗体和减少突破性感染相关。最近的大型GWAS研究解析了DQB1 * 06:04、DQA1 * 01:02、DQA1 * 01:01、DRB3 * 01:01和DPB1 * 10:01并发现对抗体和保护的加性效应。这些结果突出了CD4⁺ T细胞对B细胞的辅助功能，并提出HLA多态性是否通过CD4⁺ 表位肽选择性发挥其效应以及某些CD4⁺ 表位是否比其他更具保护性。然而，将CD4⁺ 表位与免疫学结果联系起来的研究常发现CD4⁺ 表位由多种HLA等位型泛素呈递，这似乎是SARS-CoV-2刺突中许多CD4⁺ 表位的共同特征。显性CD4⁺ 表位的天然加工作用在研究免疫印记机制时凸显，尤其是感染和疫苗接种期间不同病毒株刺突蛋白配对产生的杂交免疫阻尼。

在早期报道免疫显性CD4⁺ 表位后，研究人员注意到某些SARS-CoV-2刺突CD4⁺ 表位位于以构象灵活性为特征的段中，这对显性CD4⁺ 表位是罕见的。为探究CD4⁺ 表位优势，研究人员设计了在IL-2 Elispot分析中能基于APL评分区分致敏环境的刺突肽池。在大流行第二年，许多人接种了疫苗，部分人是首次暴露于SARS-CoV-2刺突，另一些此前曾感染病毒。感染与疫苗接种后选定CD4⁺ 表位应答的差异此前已被指出。此处研究人员强调多次刺突暴露过程中CD4⁺ 表位免疫优势的大范围转移，并提供证据显示这些转移基于抗原加工。研究人员还在未接种疫苗的非住院感染个体队列中的中度和轻度疾病组之间发现免疫优势类似的转移。

主要关键技术方法包括：使用抗原加工可能性（APL）算法基于局部蛋白构象灵活性稳定性信息分析SARS-CoV-2刺突结构；对可溶性重组SARS-CoV-2刺突胞外域进行有限蛋白水解并使用质谱鉴定切割位点；从Community Seroepidemiology and Immunity（CSI）研究及Ochsner健康中心收集人类受试者外周血单个核细胞（PBMC）样本；使用IL-2 Elispot分析检测PBMC对稳定（9S）与不稳定（9U）构象区域肽池的应答并计算9S:9U比率；通过肽对比率相关性分析部分解卷积9S与9U池的CD4⁺ T细胞应答贡献。

研究结果部分保留小标题如下：

抗原加工可能性。研究人员比较了多种SARS-CoV-2刺突构象的基于APL的CD4⁺ 表位预测谱与2023年IEDB数据库报告的CD4⁺ 表位优势。这些免疫显性肽在49至80%先前感染受试者中产生应答。由于完整刺突多肽在脱落或感染后在S1-S2连接处被切割，或在疫苗接种后抗原加工早期阶段在S1-S2连接附近被切割，S1和S2链被分开考虑。评估了多种S1和S2构象的APL，包括全RBD向下（PDB:6VXX）和3-RBD向上（PDB:7DCC）构象的S1，以及融合前（PDB:6VXX）或融合后（基于PDB:6B3O的模型）构象的S2。对于S1，使用任一结构的APL预测了部分CD4⁺ 表位但未达到整体显著准确性。值得注意的是，使用相同重叠肽集通过MHCII结合（7等位基因法）或根据免疫肽组学观察分配评分也未产生显著准确性。APL的结果出乎意料，鉴于APL对HIV Env和流感HA的良好准确性。APL对普通感冒冠状病毒OC43的融合前刺突S2相当准确（结合MHCII时更准确），但对SARS-CoV-2的S2融合前结构不准确。使用S2融合后构象时APL准确度适中。结论为单一结构APL预测有限，需考虑构象变异及S1-S2切割影响。

有限蛋白水解。APL表现一般引出使用可用结构不充分模拟刺突蛋白水解加工的可能性。研究人员分析了含有抑制向融合构象转化并增强细胞培养中蛋白生产的脯氨酸残基的可溶性重组SARS-CoV-2刺突胞外域的有限蛋白水解。选择蛋白酶基于与II类途径抗原加工的关联（组织蛋白酶S（cathepsin S））或弱序列特异性（蛋白酶K（proteinase K））。从SDS-PAGE凝胶中提取大片段并进行 exhaustive 胰酶消化和质谱鉴定。映射了spike-2P中几个PK和CS切割位点到最近残基。两种酶生成的spike-2P或spike-6P蛋白水解片段类似于S1和S2片段。在spike-2P的S1中，大片段由N2R连接子和SD1内几个位点切割产生，这些蛋白酶敏感区均位于构象不稳定段。在spike-6P的S1中，片段指示在N2R和SD1相似位点切割，也在RBD不稳定区。在spike-2P的S2中，几个大CS和PK片段源于上游螺旋N端侧切割及beta发夹C端侧位点。在spike-6P的S2中，主要片段延伸自CS和PK切割位点分别位于上游螺旋C端侧和融合肽至中央螺旋和亚域3内的PK位点。因此有限蛋白水解检测到spike-2P和6P共有的几个切割敏感区，包括S1/S2加工位点、N2R和SD1区域，以及spike-6P中相比spike-2P观察到或未观察到或位置偏移的其他位点。所有蛋白酶敏感位点均位于刺突构象不稳定段，某些位点利用受影响刺突构象的脯氨酸取代调节。确认APL分析预测刺突蛋白水解敏感性区域后，研究人员探讨蛋白水解抗原加工是否随个体受试者和暴露环境而变化。

源自刺突稳定和构象不稳定区域的显性表位的CD4⁺ T细胞应答。为比较个体间对刺突稳定和构象不稳定区域CD4⁺ T细胞应答频率，研究人员从BEI Resources阵列中根据其在SARS-CoV-2感染后康复个体中的优势选择了18个肽。这18个刺突肽通过刺突三聚体全RBD向下冷冻电镜结构的构象稳定性分析分为9S稳定和9U不稳定池。各自9S和9U肽的APL值分别高于和低于18个肽的平均值0.29。所选肽均无超过50%与普通感冒冠状病毒同源性，且无报道显示由普通感冒冠状病毒引发T细胞应答回忆。收集2020年6月12日至2022年12月5日Community Seroepidemiology and Immunity（CSI）研究血液样本，涵盖delta和omicron BA.1波。测试冻存PBMC对外源9S和9U肽池的IL-2 Elispot形成。选择IL-2而非IFNγ因CD8⁺ T细胞贡献极小。每孔3e5细胞用2 μg/mL各肽的肽池刺激，最多六重复。尽管初始关注COVID-19感染，疫苗快速部署允许比较两种不同SARS-CoV-2刺突暴露途径产生的免疫应答。至2021年6月许多受试者已接种；因此检查52名感染或感染然后接种mRNA疫苗（辉瑞或Moderna）队列的9S和9U肽池IL-2应答。未接种受试者感染以来中位时间106天，接种者第二针以来中位时间37天。通过分析空白校正IL-2 Elispot计数，仅感染与感染然后接种受试者对9S和9U肽池应答无显著差异。鉴于Elispot应答幅度个体间高度可变，研究人员分析未校正原始Elispot计数的9S:9U比率，预期非特异性应答贡献受控同时允许从每个受试者有效配对的9S和9U信号浮现更多信息。该分析发现感染然后接种受试者的9S:9U比率显著大于仅感染受试者。接种前后配对样本也显示接种后9S:9U比率增加。两名受试者纵向9S和9U应答说明接种后9S应答的选择性增强。随着人群持续接种，组装71名受试者队列，76%有感染史，24%仅接种未感染。许多既往感染者有复杂暴露史。研究人员确定每名受试者所有采样中的最大9S:9U比率，然后比较感染然后接种与仅接种者的最大平均值，发现仅接种者平均最大9S:9U比率显著更高。

CD4⁺ T细胞对9S和9U肽池应答的部分解卷积。为部分解卷积9S和9U池个体肽的贡献，对13个9S和9U池合计产生每10⁶ PBMC超过15个斑点的样本子集进行额外IL-2 Elispot分析。研究人员推理选定肽对（50-51）:（64-65）或（124-125）:（107-108）的应答比率变化若这些CD4⁺ 表位对池应答有实质贡献则会重述9S:9U比率变化。9S池的肽50–51位于RBD构象稳定N端部分，9U池的肽64–65位于RBD相对不稳定C端部分。9S池的肽124–125位于融合前构象融合肽C端螺旋区，9U池的肽107–108位于S1-S2切割位点和S2'切割位点之间的上游螺旋（UH）。预期这些肽对应答在队列中频繁因其限制HLA等位型常见。发现（50-51）:（64-65）比率与9S:9U比率相关，而（124-125）:（107-108）比率与9S:9U比率不相关。因此9S:9U比率变化由S1肽对50–51和64-65的比率主导。

独立人类受试者队列的CD4⁺ T细胞应答。为在单独队列中寻求佐证，研究人员用2023年5月至8月在Ochsner健康中心近期感染COVID-19并寻求医疗护理的20名受试者PBMC进行IL-2 Elispot分析。血样在COVID-19检测阳性后4至14天内收集。9名受试者曾有1或2次既往感染，除一名外均接受1至7次mRNA疫苗注射。为分析9S:9U比率与刺突暴露关系，研究人员创建SARS-CoV-2刺突暴露简单评分作为所有感染总和（每次感染值1）。线性回归评估显示9S:9U比率与感染评分呈显著负斜率。在对16个样本子集部分解卷积9S和9U池时，肽对与9S:9U比率的相关性不同于CSI队列。此案例中（50-51）:（64-65）与9S:9U比率不相关，但（124-125）:（107-108）比率与9S:9U比率相关。因此该受试者队列中9S:9U比率变化由S2肽对124–125和107–108主导。

与其他队列及潜在疾病严重性的关系。免疫表位数据库（IEDB）的CD4⁺ 表位谱证实感染和疫苗接种观察到的独特9S:9U比率。感染后的CD4⁺ T细胞应答更广泛、强健且由不同肽簇主导，相较于疫苗接种后。特别值得注意的差异发生在RBD区域。感染靶向RBD C端附近的9U肽64和65，疫苗接种靶向RBD N端附近的9S肽50和51。当汇总IEDB报告的所有9S和9U肽分数应答时，感染9S:9U比率小于1，疫苗接种大于1。在本研究一个单独工作中，64名感染未接种受试者根据免疫参数和临床特征分为两簇。简言之，一簇报告更严重症状并呈现Th1偏斜免疫；另一簇报告较轻症状并呈现较少Th1偏斜免疫。通过IL-2 Elispot分析，较少Th1偏斜簇产生比Th1偏斜簇升高的9S应答；而两簇9U应答无区别。

讨论部分总结：SARS-CoV-2感染和疫苗接种产生的CD4⁺ T细胞表位优势的不同模式表明免疫致敏的复杂差异可能驱动疾病严重性和保护的不同结果。代表刺突中构象相对稳定（9S）或不稳定（9U）结构背景中少数免疫显性CD4⁺ 表位的小肽池报告不同应答水平取决于初始暴露环境。在来自两个不同人类受试者队列的感染和接种疫苗个体横断面以及既往感染个体接种后纵向应答中发现9S:9U比率差异。此外，IEDB中群体水平的CD4⁺ 表位映射数据揭示了可比模式。这些研究表明不同CD4⁺ 表位优势模式源于暴露于刺突蛋白的细节而非受试者HLA组成或实验室实验方法的变异。合理机制包括与疫苗递送和加工相关的差异，如首次暴露组织、局部佐剂效应、细胞因子环境、树突状细胞亚群及引流淋巴结中的抗原处理。尽管疫苗刺突蛋白具有如脯氨酸稳定等区别于循环病毒刺突的特征，但这些修饰不影响CD4⁺ T细胞识别刺突其他地方的肽-MHCII复合物，也不会影响远处肽与MHCII的结合除非修饰通过完整刺突多肽或大片段施加影响。因此区分刺突分子内CD4⁺ 表位致敏的机制最可能作用于抗原加工水平。

对9S和9U肽池应答的部分解卷积揭示取决于人类受试者队列的S1或S2中显性CD4⁺ 表位含段。CSI队列中（50-51）:（64-65）比率与9S:9U比率相关，但Ochsner队列中（124-125）:（107-108）比率与9S:9U比率相关。至少两个队列不同特征可解释此差异。首先，CSI队列大流行早期采样（2020-2022）与Ochsner队列晚期采样（2023）导致Ochsner队列累积暴露更多且流行变异株已改变。CD4⁺ 表位优势可能转向S2因为S2 CD4⁺ 表位（如肽124-125）在SARS-CoV-2变异株间更保守且T细胞通过与其他来源（如普通感冒冠状病毒刺突或细菌抗原）CD4⁺ 表位交叉反应维持更高水平。然而与普通感冒冠状病毒显著交叉反应似乎不可能因为几个显示为与普通感冒冠状病毒刺突肽交叉反应的S2 CD4⁺ 表位（包括肽117、136和141）被刻意排除在9S和9U池外。Omicron BA.1获得影响肽108应答的突变，但对原始肽应答丧失不能解释随感染次数增加S2肽对（124-125:107-108）应答比率减小。肽124–125和107–108应答似乎由群体中很大一部分共生菌致敏。因此对这些肽应答的变化可能源于常住细菌变化。其次，CSI受试者暴露至采样的中位间隔更长（疫苗接种后一个月或感染后三个月）相比Ochsner受试者（感染后10天）。由于交叉反应T细胞应答比新型T细胞应答衰减更快，更具交叉反应的S2应答可能在Ochsner队列采样时仍存在但在CSI队列采样时已衰减。

鉴于一些研究表明缺陷性CD4⁺ T细胞应答要么允许病毒发病要么引起免疫病理，研究人员试图检验CD4⁺ 表位免疫优势是否与替代免疫学结果相关的假设。极少研究探讨疾病严重性与某些CD4⁺ 表位比较优势是否相关。在冠状病毒早期模型中，C3H/HeJ（I-E^k）小鼠经历小鼠肝炎病毒（MHV）严重感染，C57BL/6（I-A^b）小鼠仅轻微感染。作者报道MHV刺突应答中CD4⁺ 和CD8⁺ 表位免疫优势的不同模式，但肺病理仅与CD4⁺ T细胞应答相关，由小鼠遗传背景塑造。在西尼罗河病毒感染人类中，不同CD4⁺ 表位与重症相关，归因于病毒包膜蛋白E构象和蛋白水解加工的转变。对于幽门螺杆菌感染，保护性抗原HpaA中数个DR和DQ限制等位型应答已映射；对一个DRB1 * 15:01限制的CD4⁺ 表位应答与较轻胃部疾病相关。尽管至多初步，本研究观察到具有较轻COVID-19症状簇中升高的9S:9U比率提示稳定刺突段中的表位优势支持更好结果。值得进一步研究CD4⁺ 表位优势与疾病严重性及疫苗保护性的关联。

刺突中显性CD4⁺ 表位加工弱可能与疾病严重性相关。如上所述，计算显性肽的平均APL并不显著大于所有刺突肽的平均APL。此结果出乎意料因为基准抗原集合中大多数显性CD4⁺ 表位具有高于平均的APL值。APL算法预测构象稳定抗原段中的免疫显性CD4⁺ 表位，尤其是那些邻接不稳定、蛋白酶敏感段的。仅在基准抗原中观察到少数CD4⁺ 表位具有低APL。这些低APL CD4⁺ 表位通常在20个或更多残基的构象不稳定段中，通常对MHCII蛋白具有异常高亲和力。此类CD4⁺ 表位被称为蛋白水解独立，可能依赖高亲和力MHCII结合以保护免于蛋白水解。构象不稳定抗原段中的CD4⁺ 表位也被鉴定用于在MHCII分子能在蛋白水解加工前结合抗原的条件下体外加工。在相关工作中，álvaro-Benito等考虑SARS-CoV-2抗原特异性切割并尝试推导机制见解，而Sadegh-Nasseri和Kim考虑引导结合与切割的结构特征作用。鉴于刺突中低APL CD4⁺ 表位比例异常大，研究人员假设这些CD4⁺ 表位的免疫原性是由于干扰抗原加工的因素。

研究人员试图绕过在五十多名人类受试者队列中映射刺突CD4⁺ 表位的挑战，同时发现CD4⁺ 表位免疫优势中有意义的非MHCII特异性差异。典型血液样本有限阻碍CD4⁺ 表位优势分析，且多样HLA等位型呈递的可能CD4⁺ 表位数量庞大使问题加剧。因此研究人员创建合理设计的肽池以揭示免疫关联。类似方法中，研究者报道了对跨越SARS-CoV-2刺突S1和S2部分的肽池的CD4⁺ T细胞应答差异。COVID-19感染后增强的对9U肽相较9S肽的应答表明感染诱导构象不稳定抗原段中CD4⁺ 表位的致敏，这些段通常在其他病原体显性抗原中无免疫原性。S1中的9U CD4⁺ 表位发生在可能与抗原加工产生早期蛋白水解片段切割位点重合的不稳定区域。肽24和64–65在全RBD向下刺突三聚体冷冻电镜结构中是无序的。线性抗体表位必须表面暴露并能适应抗原结合位点，已在9U肽24和30-31中鉴定，但不在9S肽50-51中。尽管在全RBD向下刺突中不是柔性无序，肽74的局部构象在RBD向上旋转朝向其受体期间重新排序。在以激进蛋白水解为特征的细胞环境中，9U CD4⁺ 表位的低构象稳定性应导致这些段在被装载入MHCII前降解。这些CD4⁺ 表位如何逃避蛋白水解未知。一种可能是病毒抑制先天免疫减少树突状细胞活化从而抑制蛋白水解活性。

感染中优先致敏9U CD4⁺ 表位的解释仍不清楚。Tarke等指出显性刺突CD4⁺ 表位具有异常广泛的MHCII亲和力。因此9U CD4⁺ 表位优势可能部分由于MHCII独立因素。S2在融合后构象变化中的大重组极可能影响S2 CD4⁺ 表位加工。融合肽（肽117）从疫苗中高度免疫原性转为感染期间适度免疫原性。此免疫原性大差异可由从上端螺旋（UH）末端至第一个七肽重复（HR1）起始的大段S2有序到无序转变解释，这可能暴露融合肽于蛋白水解降解并降低免疫原性。spike-2P和spike-6P中远离spike-6P特定取代的蛋白酶敏感位点差异突出了构象变化影响抗原加工的潜力。此机制也可解释疫苗接种者中较高（124-125）:（107-108）比率，因为肽124–125位于感染期间展开的S2段。展开124–125区域可能被蛋白水解降解因此在感染期间免疫原性较低。相比之下肽107-108作为UH一部分在构象变化中保持折叠，抵抗蛋白水解，并在两种暴露中被观察为免疫原性。事实上APL预测融合构象变化后肽107–108免疫原性增加，如在感染受试者中观察。

S1中转向更大9S应答可能由印记机制解释。Tarke等观察到显性SARS-CoV-2刺突CD4⁺ 表位通常不重合于普通感冒冠状病毒刺突的显性CD4⁺ 表位（某些S2表位除外）。此观察提出CD4⁺ 表位弱交叉反应性可能降低其致敏初始T细胞应答的能力，这相当于一种抗原印记或原始抗原罪。Smith及同事注意到对融合肽（肽117）的记忆应答比初始应答增殖性低。Stern及同事也注意到无充分解释为何感染SARS-CoV-2后对肽117显性交叉反应应答无深刻放大。这些未解决问题强调CD4⁺ 表位结构背景可能控制应答强度。在同源性抗原如SARS-CoV-2和普通感冒冠状病毒刺突背景下，稳定区域序列保守性升高。因此可能期望稳定区域显性CD4⁺ 表位存在偏向，常规普通感冒冠状病毒感染留下印记之处。

本研究局限性包括用于探测刺突潜在加工位点的蛋白酶数量少、使用可溶性稳定重组刺突而非类原生膜结合刺突作为感染模型、集中于完整刺突初始蛋白酶切割位点而非多次切割事件的下游产物。然而多项研究记录了构象无序蛋白段的极端和泛敏蛋白水解切割敏感性，即使不同蛋白酶对切割位点最近残基类型有适度特异性。除本文报道的CS和PK位点外Zhao等报道了N2R和SD2区域的cathepsin L位点。原生刺突在病毒或细胞膜上的排布可能影响其构象及蛋白酶可及性，尤其是刺突膜近端区域。虽未解决此特定考量，但强调局部结构环境及其如何受暴露环境调节已被阐明应进一步研究。加工及同时装载入MHCII的复杂途径远未被充分模拟；尽管如此，基于其结构背景阐明了三种CD4⁺ 表位类型：蛋白酶独立、蛋白水解幸存者和加速型（如早期中间体），在APL算法中具有不同权重。APL在考虑邻接不稳定蛋白酶敏感位点时最准确的事实表明加速加工是MHCII装载的重要途径。早期加工事件的重要性已在过敏原Bet v 1显性CD4⁺ 表位中最优雅描述，其中最具免疫原性CD4⁺ 表位见于最早溶酶体酶消化产物。本工作中未细察SARS-CoV-2个体CD4⁺ 表位免疫优势或加工途径，因此无法识别机制步骤。然而检查CD4⁺ 表位区域和CD4⁺ 表位子集（以APL评分区分）支持在人类受试者中比较并节省有限血液样本体积。

研究结论部分翻译：SARS-CoV-2感染和疫苗接种产生的不同CD4⁺ T细胞表位优势模式表明免疫致敏的复杂差异可能驱动疾病严重性和保护的不同结果。代表刺突中构象相对稳定（9S）或不稳定（9U）结构背景中少数免疫显性CD4⁺ 表位的小肽池报告不同应答水平取决于初始暴露环境。在来自两个不同人类受试者队列的感染和接种疫苗个体横断面以及既往感染个体接种后纵向应答中发现9S:9U比率差异。此外免疫表位数据库（IEDB）中群体水平的CD4⁺ 表位映射数据揭示了可比模式。这些研究表明不同CD4⁺ 表位优势模式源于暴露于刺突蛋白的细节而非受试者人类白细胞抗原（HLA）组成或实验室实验方法的变异。合理机制包括与疫苗递送和加工相关的差异，如首次暴露组织、局部佐剂效应、细胞因子环境、树突状细胞亚群及引流淋巴结中的抗原处理。尽管疫苗刺突蛋白具有如脯氨酸稳定等区别于循环病毒刺突的特征，但这些修饰不影响CD4⁺ T细胞识别刺突其他地方的肽-MHCII复合物，也不会影响远处肽与MHCII的结合除非修饰通过完整刺突多肽或大片段施加影响。因此区分刺突分子内CD4⁺ 表位致敏的机制最可能作用于抗原加工水平。