综述：增强间充质干细胞技术的进展：创新与治疗应用

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Advances in enhanced mesenchymal stem cell technologies: innovations and therapeutic applications

　　

间充质干细胞（MSCs）在再生医学的临床转化中引起了广泛关注，主要归因于其经过验证的旁分泌效应（paracrine effects）、显著的免疫调节特性（immunomodulatory properties）以及优越的多向分化能力（multipotent differentiation capabilities）。然而，MSCs有限的归巢效率（homing efficiency）和较差的移植后存活（post-transplant survival）严重损害了治疗效果，从而导致次优且不一致的治疗结果。为规避这些关键缺陷并充分发挥MSCs的治疗潜力，研究人员整合了多种有效策略，包括基因工程（genetic engineering）、细胞因子（cytokines）、小分子化合物（small molecular compounds）或低氧刺激（hypoxic stimuli）的预处理（preconditioning）以及基于支架的培养系统（scaffold-based culture systems）。鉴于这些有前景的研究进展，本综述系统总结了MSC增强治疗策略的最新进展，并详细阐述了其核心分子机制以及这些机制如何调节MSC的存活、归巢能力和免疫调节功效。在此基础上，研究人员进一步分析了这些增强型MSCs在临床试验中的实际适用性，并力求为基于MSC的增强疗法的临床选择提供关键见解。

论文主体部分总结如下：

**1 引言**
间充质干细胞（MSCs）是一种多能成体干细胞，具有自我更新和多向分化能力。根据组织来源，MSCs可分为骨髓来源MSCs（BMSCs）、脂肪组织来源MSCs（AD-MSCs）、脐带来源MSCs（UC-MSCs）、脐带血来源MSCs（UCB-MSCs）和沃顿胶来源MSCs（WJ-MSCs）等亚型。所有MSCs亚型均表现出显著的多向分化潜能，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经元和基质细胞。此外，MSCs还具有强大的旁分泌效应（paracrine effects），分泌生物活性细胞因子和富含蛋白质及miRNA的功能性外泌体。通过这些分泌的生物活性因子，MSCs介导一系列关键生物学功能，包括免疫调节（immunomodulation）、抗凋亡、组织再生和促进血管生成。此外，由于MSCs低表达MHC-I且不表达MHC-II及关键共刺激分子，其免疫原性低，有利于异体移植。截至2026年4月，WHO国际临床试验注册平台（ICTRP）显示全球已正式注册1470项针对MSCs的临床试验，并有19种基于MSCs的疗法获得监管批准用于疾病治疗。尽管有这些显著优势，MSCs在临床试验和验证研究中的结果不理想，严重损害了其转化潜力。

**2 MSCs优化策略**
MSCs的临床应用面临两大限制：静脉注射后向病变部位的归巢效率不足，以及由严重缺血、缺氧、炎症应激和过度氧化应激构成的恶劣微环境导致的细胞活力下降和快速凋亡。为克服这些瓶颈，研究人员从不同角度设计了多种策略，包括基因工程（genetic engineering）、低氧预处理（hypoxic preconditioning）、细胞因子预处理（cytokine pretreatment）和生物材料支架辅助细胞递送系统（biomaterial scaffold-assisted cell delivery systems）。

**2.1 MSCs的基因工程**
基因工程通过异位过表达抗凋亡因子（如热休克蛋白（HSPs）、生物活性细胞因子和趋化因子）可显著促进MSCs在体内外的存活和增殖潜力。此外，靶向基因敲除和RNA干扰（RNAi）是合理的基因工程补充策略。

**2.1.1 细胞因子和抗凋亡蛋白**
通过基因工程使MSCs异位过表达生物活性生长因子和抗凋亡基因（如HSPs和BCL-2），可增强MSCs的存活潜力和内在治疗功效。例如，在心肌梗死（MI）和脑卒中疾病中，过表达HSP70通过PI3K/Akt通路增强MSCs在急性肺损伤（ALI）大鼠中的存活率和抗凋亡能力。肝细胞生长因子（HGF）激活Akt信号通路并增强MSCs的旁分泌分泌，从而增强其在恶劣病理微环境中的活力。血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）通过增强旁分泌分泌能力，改善了MSCs在氧糖剥夺（OGD）和MI体外模型中的存活。成纤维细胞生长因子-21（FGF-21）抑制caspase激活，减轻暴露于H₂O₂的MSCs的凋亡。直接异位过表达BCL-2和Akt1发挥强效抗凋亡作用，保护MSCs免受OGD和移植物抗宿主病（GVHD）中的凋亡损伤。这些基因主要靶向Akt信号通路，并调节BCL-2和caspase家族蛋白。

**2.1.2 趋化因子受体和细胞间黏附分子**
异位过表达趋化因子受体和黏附分子通过调节多种信号通路显著增强MSCs向病理损伤部位的归巢能力。例如，过表达CCR2、CXCR5、CXCR2、CCR1、CXCR4、ICAM-1、EP2和CXCR7等基因在多种疾病模型中显示出归巢促进效果。此外，非编码RNA如miRNA也可调节内源性趋化因子受体/配体，例如下调miR-141（靶向ICAM-1）和miR-139（靶向CXCR4）可增强MSCs在溃疡性结肠炎小鼠中的归巢。MSCs的归巢级联反应大致分为五个阶段：滚动、激活、牢固黏附、爬行和迁移。在实际应用中，候选基因的选择需精确匹配靶病灶的致病机制和位置，例如在MI中，CXCR4是首选基因；在急性肝衰竭（ALF）中，CCR2是最优选择。

**2.2 MSCs培养工艺的优化**
基因修饰虽能显著增强MSCs功能，但存在遗传毒性风险和脱靶效应等安全性问题。因此，研究人员通过改变培养条件来实现MSCs的预期表型或目标基因高表达。基于MSCs的适应性微环境，采用低氧、生物激活剂、支架或三维（3D）培养进行预处理可显著增强其治疗潜力。

**2.2.1 细胞因子预处理**
细胞因子预处理是增强MSCs存活、归巢和治疗功效的常用策略。存活能力受多种信号通路调节，关键机制是相关因子激活信号通路上调BCL-2。例如，TNF-α通过NF-κB通路、Mitsugumin53（MG53）通过NLRP3/caspase-1/IL-1β通路、Vaspin通过MAPK/p38通路上调BCL-2。LPS、促红细胞生成素（EPO）和b-FGF分别通过TLR4/PI3K/Akt、SIRT1和Kruppel样因子4（KLF4）通路发挥促存活作用。SDF-1α和低浓度TGF-β1也能促进MSC存活。归巢能力与CXCR4表达密切相关，TNF-α、SDF-1和EPO通过上调CXCR4促进归巢，其中TNF-α通过NF-κB通路，EPO通过抑制Notch1/Jagged通路。TGF-β1、LPS、MG53、血小板裂解物（PL）、IFN-γ、IL-1β和b-FGF通过非经典信号/N-cadherin轴、TLR4/IRF1/NF-κB/PI3K、Nrf2和AMPK/mTOR等通路增强归巢。免疫调节方面，MSCs通过多种途径发挥作用，如IFN-γ刺激诱导吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）表达，MSCs分泌TGF-β1和HGF，以及通过程序性死亡-1（PD-1）及其配体PD-L1/PD-L2、分泌IL-10等。细胞因子预处理进一步放大这些免疫调节能力，例如TNF-α和LPS预处理的MSCs来源外泌体通过诱导M2巨噬细胞极化增强免疫调节；IFN-γ、TNF-α和IL-1β预处理上调PD-1配体表达；IL-1β预处理提高IL-10和TGF-β分泌。此外，b-FGF、TNF-α、EPO和PL可增强MSCs的血管生成能力，IFN-γ促进抗纤维化活性。

**2.2.2 化合物预处理**
生物活性化合物作为细胞因子预处理的替代方案，具有生产成本低和理化稳定性好的优势。天然化合物通过三种途径保护MSCs免受氧化应激损伤和凋亡：激活经典细胞存活信号通路、调节凋亡相关基因表达、调节抗氧化酶活性和活性氧（ROS）。这些天然化合物如油酰乙醇胺、虾青素、新绿原酸、白杨素、高密度脂蛋白、硒代蛋氨酸、维生素C/E/D₃、淫羊藿素、银杏叶提取物等，其作用机制多与PI3K/Akt相关。此外，雷帕霉素、去铁胺、肝素和GSK-3β抑制剂可上调CXCR4表达促进归巢。临床批准合成的化合物如褪黑素通过激活PI3K/Akt减弱氧化应激诱导的MSCs凋亡；丙戊酸钠（VPA）通过激活Akt/PI3K和SDF1/CXCR4通路促进缺血再灌注损伤（IRI）中的归巢；重组人生长分化因子7（rhGDF7）激活AMPK通路改善脑缺血再灌注（I/R）损伤。

**2.2.3 低氧预处理**
低氧预处理模拟体内生理性低氧微环境，主要增强MSCs的存活和归巢效果。低氧反应由低氧诱导因子1（HIF-1）介导。常用氧浓度为0.1%至2%，不同浓度产生不同功能效果。例如，2% O₂预处理通过HIF-1α/GRP78/Akt/JAK2/STAT3通路增强MSCs存活和血管生成细胞因子分泌；0.5% O₂预处理通过调节Kv2.1在FAK磷酸化/激活中增强归巢能力。低氧预处理面临氧浓度效应差异、精确控制技术难题和长期安全性数据不足等挑战。

**2.2.4 基于支架的系统与3D培养**
相比传统二维（2D）培养，体内细胞处于复杂的三维（3D）微环境。生物材料支架和3D球体可重建体内微环境，调控MSCs的活性、增殖和分化。

**2.2.4.1 基于支架的系统**
支架分为三类：2D支架（如壳聚糖膜）、3D静态支架（如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、水凝胶、脱细胞基质、3D打印支架）和3D动态悬浮支架（如微载体）。壳聚糖-透明质酸膜通过表面自组装诱导3D球体形成，维持干细胞标志物表达并增强软骨分化潜能。3D多孔脱细胞软骨ECM（ACECM）支架培养的MSCs来源外泌体通过miR-125a/miR-29a/NF-κB p65/NLRP3轴促进M2巨噬细胞极化，修复骨软骨缺损。微载体方面，可注射明胶微晶胶（GMs）与AD-MSCs结合改善MSCs在临界肢体缺血（CLI）模型中的滞留和存活，并支持了首个干细胞药物“艾米迈托西注射液”的批准。2D支架易于制备但可扩展性有限；3D静态支架提供定制化微环境但存在扩散限制；3D动态支架具有优越传质效率，适合大规模细胞生产。

**2.2.4.2 3D球体培养**
3D球体是无支架的3D培养策略，增强细胞间相互作用。常用技术包括悬滴法、磁力悬浮、低黏附培养和旋转培养。悬滴法生成的3D球体通过PI3K/pAkt/pNrf2和pERK/pNrf2信号通路减轻氧化应激和凋亡，促进软骨再生，并增强抗炎、趋化和血管生成活性。旋转培养系统（如摇瓶、搅拌槽生物反应器）可大规模生产高均匀性球体，例如与TGF-β3联合使用增强WJ-MSC球体的外泌体分泌和伤口愈合功效。悬滴法操作简单但球体大小不一致；磁力悬浮可快速形成球体但可能干扰定量分析；低黏附培养适合高通量但长期培养困难；动态培养产生均匀球体且支持大规模生产，但设备成本高。

**3 临床进展**
截至2026年4月，中国临床试验注册中心有18项、ClinicalTrials.gov有50项功能增强型MSCs的临床试验注册。其中，超过82%的试验聚焦于基于支架的MSC疗法（包括3D培养），仅有少数试验涉及基因工程、低氧预处理和其他预处理策略。基于支架的MSC疗法因其良好的安全性和生物相容性而广泛被采用，但大多处于早期临床试验阶段（I期或I/II期），临床转化缓慢可能源于缺乏标准化GMP（良好生产规范）方案、支架-MSC构建体对人体微环境的不同生物学反应以及长期安全性证据不足。

**4 讨论**
本文系统回顾了提高MSCs临床疗效的各种策略，包括基因修饰和培养条件优化。这些方法在临床前和临床研究中显示出潜在治疗潜力，但仍面临一定局限性，如修饰细胞的潜在致瘤性、高剂量小分子预处理的毒性、3D培养中营养梯度引起的异质性以及免疫排斥风险。解决方案包括：使用更安全的CRISPR-Cas9定点插入和RNA基非整合系统；选择已批准药物并优化洗涤过程；优化生物反应器和应用细胞支架；采用无细胞外泌体替代疗法。在3D培养中，营养梯度可导致异质性，但也可被设计用于引导MSCs在3D空间中进行有序谱系分化。基因编辑、3D动态培养和智能响应支架的组合有望实现体外直接“打印”功能性人工器官。无细胞外泌体疗法（MSC来源细胞外囊泡，MSC-EVs）是低免疫原性、低致瘤潜力和更好储存性的前景方向，但面临批次间功能变异性和质量控制方法不足等挑战。对亲代MSCs进行预处理（低氧、细胞因子、3D培养）可增强MSC-EV产量和治疗功效，支架介导的控释可解决游离EV半衰期短的问题。

**5 结论**
MSCs通过旁分泌信号和多向分化等机制发挥治疗效果，包括抗凋亡、归巢、免疫调节和血管生成等。然而，其归巢效率低和在损伤部位恶劣微环境中的低存活率限制了进一步应用。本综述系统检查了基因修饰、低氧预处理、细胞因子或化合物预处理以及与支架联合治疗等策略。这些增强方法虽多样，但共享共同机制通路，例如多数修饰策略通过激活PI3K/Akt信号通路改善MSCs存活、归巢、旁分泌活性和免疫调节。最优策略的选择需基于特定临床需求，例如骨科应用优先考虑支架系统的结构整合和机械支撑，而免疫相关疾病可能更多受益于基因工程增强MSCs的抗炎和免疫调节能力。