人呼吸道合胞病毒Pre-F蛋白联合不同佐剂在BALB/c小鼠中保护效果的比较

《Frontiers in Immunology》：Comparison of the protective effect of human respiratory syncytial virus Pre-F protein combined with different adjuvants in BALB/c mice

　　

引言：人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus，HRSV）在婴幼儿及老年人群中疾病负担较高。本研究采用佐剂AlOH、AlOH+CpG及BFA03，比较HRSV融合前蛋白（prefusion protein，Pre-F）在BALB/c小鼠中的保护效果。方法：研究人员将BALB/c小鼠分为三个实验组（Pre-F+AlOH+CpG、Pre-F+AlOH及Pre-F+BFA03）与三个佐剂对照组（AlOH+CpG、AlOH及BFA03）。经两次肌肉注射免疫后，研究人员检测血清中和抗体滴度，并定量IFN-γ（干扰素γ）及IL-4（白细胞介素4）分泌淋巴细胞数量。病毒攻击后，研究人员监测体重变化，测定肺病毒载量（Ct值），并对肺病理损伤进行评分。结果：实验组小鼠均表现出高中和抗体滴度及增加的IFN-γ与IL-4分泌淋巴细胞数量。攻击后第三天小鼠开始恢复体重，而佐剂组小鼠持续减重。Pre-F+BFA03免疫小鼠诱导最高中和抗体滴度（1716）、最低肺病毒载量及较轻病理损伤。Pre-F+AlOH组肺病理损伤最严重（评分2.83），肺病毒载量最高（Ct值32.2）。与BFA03佐剂相比，AlOH佐剂在小鼠中诱导Th2偏倚的体液免疫反应。Pre-F+AlOH+CpG组肺病理损伤最轻（评分2.16），诱导中和抗体及细胞免疫反应能力与BFA03佐剂相当。讨论：上述发现表明，Pre-F蛋白联合AlOH+CpG或BFA03佐剂在小鼠中提供相似保护作用，且均优于AlOH佐剂，为HRSV Pre-F蛋白疫苗开发的佐剂选择及处方策略提供参考。

论文发表在《Frontiers in Immunology》。本研究围绕人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus，HRSV）疫苗开发中佐剂选择的关键问题展开。HRSV是引起婴幼儿及老年人急性下呼吸道感染的最主要病毒病原体之一，全球疾病负担沉重，且目前尚无获批用于婴幼儿的HRSV疫苗。HRSV的融合蛋白（Fusion protein，F蛋白）存在融合前（prefusion，Pre-F）与融合后（postfusion，Post-F）两种构象，其中Pre-F含有独特的位点?等中和表位，诱导中和抗体的活性显著高于Post-F，是当前HRSV疫苗设计的核心靶点。然而，传统铝佐剂如氢氧化铝（Aluminium hydroxide，AlOH）易诱导Th2型偏倚的免疫反应，历史上甲醛灭活RSV疫苗（Formalin-inactivated RSV，FI-RSV）正是因诱导Th2偏倚而导致感染后出现增强呼吸道疾病（Enhanced respiratory disease，ERD），因此理想佐剂需在增强免疫原性的同时引导Th1型或平衡的Th1/Th2反应。新型佐剂如含TLR9激动剂的CpG寡脱氧核苷酸（CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODN）及基质型佐剂BFA03（含α-生育酚、角鲨烯和聚山梨酯80）在其它病毒疫苗中显示出潜力，但其与Pre-F蛋白联用的保护性对比尚缺乏系统评价，本研究旨在填补这一空白，为HRSV重组蛋白疫苗的佐剂筛选提供依据。

研究人员以6–8周龄雌性BALB/c小鼠为动物模型，来源为北京维通利华实验动物技术有限公司，经中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所实验动物伦理委员会批准。主要关键技术方法包括：将36只小鼠随机分为6组（每组6只），分别为3个实验组（Pre-F+AlOH+CpG、Pre-F+AlOH、Pre-F+BFA03）和3个佐剂对照组（AlOH+CpG、AlOH、BFA03）；于第0天和第21天肌肉注射免疫5 μg Pre-F蛋白（CHO-S细胞表达，含6个氨基酸突变及foldon序列与His标签）与相应佐剂；第35天（二次免疫后14天）以2×10⁵ PFU/只的HRSV-Long株攻毒；免疫后检测血清特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体（间接ELISA）与中和抗体滴度（空斑减少中和试验），采用ELISPOT检测脾淋巴细胞IFN-γ与IL-4分泌数量；攻毒后第5天取肺组织，通过实时荧光定量PCR（RT–PCR）检测病毒核酸Ct值评估病毒载量，肺组织经4%多聚甲醛固定、HE染色后由病理医师盲法评估肺泡炎、细支气管炎及炎性细胞浸润程度并评分（0–4分），每日记录体重变化，数据采用单因素方差分析及GraphPad Prism 9.0软件处理。

研究结果如下。

修饰与分析Pre-F蛋白。研究人员在CHO-S细胞中表达Pre-F蛋白，其包含S155C、S290C、A149C、Y458C、S190F、V207C六个氨基酸突变，C端添加foldon序列（GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL）及6×His标签。经亲和纯化后SDS–PAGE显示分子量约65 kDa，透射电镜下可见均匀的三聚体结构，验证蛋白纯度与结构完整性符合后续实验要求。

小鼠体液免疫反应。研究人员通过间接ELISA检测发现，实验组小鼠血清特异性IgG抗体滴度均高于佐剂对照组，其中Pre-F+BFA03组最高（1.9×10⁵），显著高于最低的Pre-F+AlOH组（4.3×10⁴，P < 0.05），Pre-F+AlOH+CpG组为9.1×10⁴（与BFA03组P = 0.1673）。空斑减少中和试验显示Pre-F+BFA03组中和抗体滴度最高（1716），Pre-F+AlOH组最低（600），Pre-F+AlOH+CpG组为1418（与AlOH组P = 0.417）。IgG亚型分析显示Pre-F+AlOH组IgG1高于IgG2a，IgG2a/IgG1比值为0.76（小于1），而Pre-F+BFA03与Pre-F+AlOH+CpG组IgG2a高于IgG1，比值显著大于AlOH组（P < 0.05），表明AlOH诱导Th2偏倚，BFA03与AlOH+CpG诱导Th1偏向或平衡反应。

小鼠细胞免疫反应。研究人员通过ELISPOT检测发现，Pre-F+BFA03组IFN-γ分泌淋巴细胞数量显著高于BFA03佐剂组（P < 0.01），Pre-F+AlOH+CpG组显著高于AlOH+CpG佐剂组（P < 0.05）。Pre-F+BFA03与Pre-F+AlOH+CpG组的IL-4分泌淋巴细胞数也显著高于各自佐剂组（P < 0.01），而Pre-F+AlOH组IL-4与IFN-γ分泌细胞数在三个实验组中最低，且低于Pre-F+AlOH+CpG组（IL-4：P < 0.05）。Pre-F+AlOH+CpG组内IFN-γ分泌细胞数显著高于IL-4（P < 0.05），表明CpG能增强AlOH的细胞免疫诱导能力，BFA03亦具相当的细胞免疫激活能力。

观察小鼠肺部病理变化与病毒载量。攻毒后第5天肺组织HE染色显示，佐剂组肺泡壁增厚、血管支气管周围大量炎性浸润，病理评分均高于3；实验组中Pre-F+AlOH+CpG病理评分最低（2.16），Pre-F+BFA03为2.66，Pre-F+AlOH最高（2.83）。RT–PCR检测肺病毒核酸Ct值显示，Pre-F+BFA03组平均Ct值35.4，显著高于Pre-F+AlOH组的32.2（P < 0.05），Pre-F+AlOH+CpG组Ct值亦显著高于佐剂组（P < 0.001），Ct值越高代表病毒载量越低，表明BFA03与AlOH+CpG联合Pre-F能有效降低肺病毒复制。

攻毒后小鼠体重变化。研究人员每日记录发现，所有组小鼠攻毒后第1–2天体重下降，实验组自第3天开始恢复，至第5天恢复至攻毒前水平；佐剂组持续下降，第5天仅恢复至攻毒前约90%，表明Pre-F免疫能提供有效的体重保护，反映整体临床获益。

讨论部分总结如下。研究人员指出FI-RSV疫苗诱导Th2偏倚与ERD的机制可能涉及甲醛破坏抗原表位、巨噬细胞通过清道夫受体摄取导致Th2反应，或G蛋白特定肽段（aa 184–196）的作用，AlOH同样具Th2偏倚风险。本研究中Pre-F+AlOH组IgG2a/IgG1 < 1、病理最重，证实单一AlOH不适于HRSV Pre-F疫苗；CpG作为TLR9激动剂可抵消AlOH的Th2偏倚，AlOH+CpG组IgG2a高于IgG1、病理最轻（2.16），中和抗体（1418）与细胞免疫与BFA03相当。BFA03组虽中和抗体最高（1716），但病理评分略高于AlOH+CpG组（2.66），提示最优保护需体液与细胞免疫平衡而非仅追求最高中和滴度。BALB/c小鼠对RSV易感性高、模型成熟但病毒复制有限，未来需在棉鼠或非人灵长类中验证。研究还指出重组Pre-F需用CHO细胞表达以保证免疫原性，大肠杆菌与酵母系统诱导中和抗体较低。综上，研究人员得出结论：Pre-F蛋白联合AlOH+CpG或BFA03佐剂在BALB/c小鼠中提供相似且优于单一AlOH的保护效果，为HRSV Pre-F蛋白疫苗的佐剂选择与处方策略提供参考。