《Genomics & Informatics》：Pre-sampling conditions affect salivary genomic DNA yield and human DNA fraction: a single-donor pilot study
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随着基于唾液的基因组分析应用不断扩展，常见采样前行为对唾液基因组DNA（gDNA）回收的影响仍缺乏明确表征。在这项单供体试点研究中，研究人员测试了由刷牙、漱口和水摄入组合而成的八种采样前条件。每种条件下采集三份唾液样本，分离细胞并使用Qiagen试剂盒提取gD
随着基于唾液的基因组分析应用不断扩展，常见采样前行为对唾液基因组DNA（gDNA）回收的影响仍缺乏明确表征。在这项单供体试点研究中，研究人员测试了由刷牙、漱口和水摄入组合而成的八种采样前条件。每种条件下采集三份唾液样本，分离细胞并使用Qiagen试剂盒提取gDNA。三因素方差分析（Three-way ANOVA）显示，刷牙是主导因素，解释了DNA产量总变异的62.9%。漱口的影响较小但显著（5.6%），而水摄入无显著影响。通过A260/280比值评估的DNA纯度在所有条件下保持稳定。为评估人与细菌DNA比例，研究人员使用RPPH1（人源）和16S rRNA（细菌）标记物进行定量PCR（qPCR）。刷牙提高了人源DNA比例但减少了回收的绝对人源DNA量，表明存在纯度-产量权衡。这些单供体试点发现为唾液基因组分析中的采样前条件提供了初步的定量指导，有待在多供体队列中验证。
该研究发表于《Genomics》。目前唾液作为非侵入性且易获取的生物样本，在上皮细胞和白细胞来源的gDNA应用于全基因组测序、单核苷酸多态性（SNP）检测和结构变异分析等方面具有重要前景，但下游基因组学效率的关键决定因素即gDNA的数量和质量会因供体采样前行为而显著变异。尽管唾液在临床和科研中的应用日益增加，但对于采样前的日常习惯如刷牙、漱口或饮水仍缺乏系统的指导，既往研究多孤立考察单一变量，缺乏在单一实验框架内对多种行为进行因子比较的系统研究，而这些行为会影响产量和纯度，例如饮食会稀释唾液细胞成分并改变蛋白质组成从而降低DNA回收率并干扰纯度测量，刷牙可能改变收集唾液的细胞和化学成分进而潜在干扰提取效率。为此研究人员通过开展单供体试点研究，系统比较由刷牙、漱口和水摄入组合定义的八种不同采样前条件，通过三重采样和定量分析评估各条件下的gDNA产量和A260/280纯度，并使用人源RPPH1和细菌16S rRNA标记物的qPCR确定这些条件如何影响回收gDNA的人源与细菌DNA比例，以提供唾液gDNA流程中控制采样前变量的试点定量指导。
研究人员为开展研究用到的主要关键技术方法如下：所有样本均来自一名健康成人，设定由刷牙（+/-）、漱口（+/-）和水摄入（+/-）定义的八种采样前条件，每种条件三重采样（n=3），采样前程序完成后1小时收集5 mL全唾液；通过添加磷酸盐缓冲盐水（PBS）混合、离心、重悬洗涤步骤分离唾液细胞；使用Puregene Blood Core Kit（Qiagen）提取细胞沉淀的gDNA；通过Qubit荧光测定法和NanoDrop分光光度计定量DNA并以A260/280评估纯度；采用23全因子设计的三种因素方差分析（Three-way ANOVA）以Qubit荧光测定数据为主要结果识别影响DNA产量的主导因素并计算各因素解释的总变异百分比；使用靶向单拷贝核基因RPPH1和通用16S rRNA引物的qPCR定量人源与细菌DNA，通过人源与细菌DNA比例标准曲线将ΔCt转换为人源DNA比例，所有统计与可视化使用GraphPad Prism 11.0.0完成，p值小于0.05视为显著。
研究结果部分保留小标题并说明如下：
3.1 Brushing significantly reduces DNA yield
研究人员通过八种采样前条件的DNA产量比较发现，非刷牙条件产量更高而含刷牙条件产量降低；采用三因素方差分析确定各因素及其交互作用解释的产量总变异比例，刷牙占62.9%为最具影响力的单一因素（p值小于0.0001），漱口占5.6%（p值等于0.0413）且水摄入无显著影响（1.8%，不显著），显著的饮水×漱口交互反映在无刷牙时漱口效应方向反转即无水摄入时漱口降低产量而有水摄入时提高产量，该反转在刷牙下不存在即无论是否水摄入漱口均降低产量，导致显著的三因素交互（p值等于0.0466），三重采样的变异系数确认总体回收一致。
3.2 Pre-sampling conditions do not affect DNA purity
研究人员基于A260/280比值评估DNA纯度，发现各条件下比值均在1.8–2.0可接受范围内且无条件特异性偏差，表明采样前干预主要影响回收DNA的量及其变异性，而测量的DNA纯度在各条件下保持稳定。
3.3 Brushing increases human DNA fraction but not human DNA recovery
研究人员通过qPCR定量人源RPPH1和细菌16S rRNA DNA并将ΔCt值通过人源与细菌DNA比例标准曲线（R2=0.9981）转换为人源DNA比例，发现八种条件下人源DNA比例范围为37.9%至89.9%，刷牙阳性条件人源DNA比例高于阴性条件（均值72.3%对比48.5%），最高值见于B+G+W+（89.9%）；绝对人源gDNA量计算为总DNA产量×人源DNA比例，范围为142至1234 ng，最高和最低人源DNA比例并不对应最高和最低绝对人源gDNA量。
讨论部分总结如下：在该单供体试点中，采样前行为沿总产量、人源DNA比例和绝对人源DNA回收三个轴影响唾液gDNA，刷牙是主导因素，其急剧降低总gDNA产量同时提高回收物中人源DNA比例（刷牙阴性条件均值48.5%升至阳性条件72.3%，B+G+W+达89.9%），该模式与机械去除细菌生物膜和牙菌斑一致，使其不再与gDNA共提取并在荧光定量中被计入，且高产量非刷牙样本伴随较低而非较高人源比例；由于刷牙在提高人源比例的同时降低总产量，人源DNA比例与绝对人源DNA回收在各条件下排名相反，最高纯度条件B+G+W+（89.9%）产生最少绝对人源DNA（142 ng），而无干预条件B?G?W?（48.0%）产生最多（1234 ng）。因此合适采样前条件取决于下游用途：若目标是最大化绝对人源gDNA量（如建库输入质量受限或单次采集需多检测），应避免刷牙，非刷牙条件平均回收约两到三倍于刷牙条件的绝对人源gDNA，因为刷牙带来的比例增益无法补偿总产量损失导致净可回收人源DNA更低；若目标是最大化人源DNA纯度（如降低全基因组或外显子组测序中微生物读取比例以提高人基因组覆盖效率），则首选刷牙尽管有产量代价，刷牙使人源比例高达89.9%以降低非人源DNA相对贡献，权衡是接受较少绝对DNA量换取更洁净且人源富集的模板。漱口效应不独立，其单独减少产量但在无刷牙且有水摄入时因水合刺激唾液流并再水化黏膜促进新鲜脱屑而非仅冲洗细胞反而提高产量，刷牙下机械磨损已脱落大部分上皮层消除此种调节；各交互项约占5%总变异与漱口主效应相当，本设计无法从日间变异分离此大小效应故机制为推测。局限性包括：仅单健康供体，个体间口腔上皮更新、唾液流率黏度及基线微生物负荷差异会影响产量和人源比例，特定值和排序未必适用于他人需多供体验证队列；八种条件在分离日期测试而非平衡随机交叉设计，处理效应混杂日间生物变异（饮食、全身水合、牙龈状态、昼夜节律）难以清晰分离小效应；供体无明显口腔疾病如牙龈炎或口干症，发现对此类人群的适用性未测试。在此限制内本研究提供了刷牙、漱口和水摄入如何在单供体中共同塑造唾液gDNA产量、人源纯度及人菌组成的初步定量描述，并建立可直用于更大规模多供体研究以定义广泛适用采样建议的qPCR工作流程。
研究结论部分翻译如下：在这项单供体试点中，采样前行为沿总产出、人源DNA分数和绝对人源DNA回收三个轴向影响唾液gDNA。在测试的三个因素中，刷牙显然是主导因素。它急剧降低了总gDNA产出，但同时提高了回收物中的人源DNA分数，从不刷牙条件下的平均48.5%提高到刷牙条件下的72.3%，在B+G+W+条件下达到89.9%。这一模式与机械去除细菌生物膜和牙菌斑相一致，否则这些生物膜和牙菌斑会与人类DNA一起被共提取并在荧光测定定量中一并计数。它还直接解决了这种担忧：高产出的不刷牙样本可能仅仅携带了更大的细菌负担而不是更多的人类DNA——qPCR数据显示，不刷牙条件下升高的粗产出伴随着更低而非更高的人源分数。由于刷牙降低了总产出同时提高了人源纯度，人源DNA分数和绝对人源DNA回收在八种条件中呈反向排序。最高纯度条件（B+G+W+，89.9%）产生的绝对人源DNA最少（142 ng），而无干预条件（B?G?W?，48.0%）产生的最多（1234 ng）。因此，合适的采样前条件取决于预期的下游用途，并且两个测量结果指向不同的选择。如果目标是最大化绝对人源gDNA量，例如当输入质量限制建库制备或需从单次收集中运行多个检测时，应避免刷牙。不刷牙条件平均回收的绝对人源gDNA大约是刷牙条件的两到三倍。这是因为刷牙带来的适度人源分数增益无法弥补随之而来的总产出的大幅损失，因此每当应用刷牙时，可回收的人源DNA净量都较低。如果目标改为最大化人源DNA纯度，例如为了减少全基因组或外显子组测序中的微生物读取比例从而提高人基因组覆盖效率，则尽管有产量代价，刷牙仍是更可取的。刷牙将人源分数提高到高达89.9%（B+G+W+），降低了提取物中非人类DNA的相对贡献。在这种情况下，权衡是接受较小绝对量的DNA以换取更干净、人源更富集的模板。漱口的效果并非独立于其他因素。漱口去除已脱落的上皮细胞，本身会降低产量，如在刷牙下观察到的那样。然而在有先前水摄入且无刷牙的情况下，漱口提高了产量，这可能是因为水合作用刺激唾液流动并再水化黏膜，使漱口促进新鲜脱屑而不仅仅是冲洗掉细胞。在刷牙下，机械磨损已经脱离了大部分上皮层，消除了这种调节。每个交互项仅占约5%的总变异，与漱口的主效应相当，且本设计无法将此种大小的效应与日间变异区分开来；因此这一机制是推测性的。若干局限性源于试点设计，在将这些观察结果推广之前应予以解决。首先，所有样本均来自单一健康供体。个体间差异如口腔上皮更新、唾液流速和黏度以及基线微生物负荷预计会影响DNA产量和人源分数，因此此处报告的具体值和排序可能不适用于其他个体；在本供体中较强的效应在他人中可能较弱、缺失甚至反转。因此在推荐任何条件作为通用标准之前，需要多供体验证队列。其次，八种条件在不同日期测试而非平衡随机交叉设计。因此处理效应与日间生物变异如饮食、全身水合、牙龈状态和昼夜节律相混淆，特别是较小效应无法从此背景变异中清晰分离。需要跨多供体的随机交叉设计来确认此处观察到的效应并自信地估计其大小。最后，该供体无明显口腔状况如牙龈炎或口干症，这些会改变上皮脱落和唾液组成，因此这些发现对此类人群的适用性仍未测试。在这些约束内，本研究提供了刷牙、漱口和水摄入如何在单供体中共同塑造唾液gDNA产量、人源纯度和人菌组成的初步但定量的描述，并建立了可直接应用于所需更大规模多供体研究以定义广泛适用采样建议的人源DNA定量的qPCR工作流程。
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