《Basic and Clinical Andrology》：A novel homozygous frameshift mutation in CFAP65 is associated with multiple morphological abnormalities of sperm flagella in a consanguineous Pakistani family
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精子鞭毛多发性形态异常（Multiple morphological abnormalities of the sperm flagella, MMAF）是严重弱精子症的一种严重形式，可导致男性不育，通常与影响鞭毛组分的遗传缺陷相关。尽管CFAP65基因已被证
精子鞭毛多发性形态异常（Multiple morphological abnormalities of the sperm flagella, MMAF）是严重弱精子症的一种严重形式，可导致男性不育，通常与影响鞭毛组分的遗传缺陷相关。尽管CFAP65基因已被证实与MMAF有关，但其完整的突变谱及在高度近亲群体中的临床相关性仍鲜有表征。为阐明该疾病的遗传基础，研究人员对来自一个近亲巴基斯坦家系的2名不育个体进行了全外显子测序（Whole-exome sequencing）及随后的桑格测序（Sanger sequencing）。研究人员利用苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin, H&E）染色评估精子形态，并利用扫描电子显微镜（Scanning electron microscopy, SEM）和透射电子显微镜（Transmission electron microscopy, TEM）评估超微结构缺陷。研究人员鉴定出CFAP65中一种新型纯合移码突变（c.582_587delinsCG; p.Q194Hfs*4）。该突变在跨膜螺旋域内引入了提前终止密码子。形态学分析揭示了典型的MMAF特征，包括超过97%的精子出现鞭毛缺失、短小、弯曲和卷曲。TEM进一步证明严重的轴丝（Axoneme）解体，在85%的横切面中观察到微管双联体缺失或破坏。根据临床病史和胸部X光检查，受累个体无慢性呼吸道症状报告且无内脏反位（situs inversus），提示为一种孤立的精子特异性表型。总之，本研究在一个近亲巴基斯坦家系中确定了一种与MMAF和男性不育相关的新型域特异性CFAP65突变，从而扩展了已知的MMAF遗传突变图谱。这些发现强化了CFAP65在精子鞭毛形态发生中的关键作用，并强调了其在男性不育遗传诊断中的重要性。
研究背景方面，精子鞭毛多发性形态异常（Multiple morphological abnormalities of the sperm flagella, MMAF）是一种以精子鞭毛弯曲、卷曲、不规则、短小或缺失为特征的严重弱精子症（Asthenozoospermia），会导致运动能力下降及男性不育，超微结构分析常显示轴丝（Axoneme）解体，包括中央微管对缺失及线粒体鞘破坏。随着二代测序（Next-generation sequencing）发展，已发现多种纤毛和鞭毛相关蛋白（Cilia-and flagella-associated proteins, CFAPs）如CFAP43、CFAP44、CFAP65、CFAP69、CFAP70及CFAP251等的致病性变异，这些基因分别作用于内臂动力蛋白锚定/锚定头（Inner dynein arm tether/tether head, IDA-T/TH）复合体、鞭毛内运输（Intraflagellar transport）、外臂动力蛋白（Outer dynein arm, ODA）相关复合体及钙调蛋白和辐条相关复合体（Calmodulin and spoke-associated complex, CSC）等不同鞭毛区段。其中CFAP43和CFAP44约占各人群MMAF病例的8%至31%。在巴基斯坦人群中，由于近亲婚姻普遍（约65%），已报道CFAP43、CFAP61、CFAP58及DNHD1的双等位基因功能缺失突变，但CFAP65在该人群中的突变谱及临床相关性仍不明确。CFAP65（亦称CCDC108、AKAP240）位于染色体2q35，含35个外显子，编码1925个氨基酸的跨膜蛋白，具ASH（ASPM-SPD2-Hydin）和MSP（Major Sperm Protein）结构域，主要在睾丸表达，对精子鞭毛生物发生及运动至关重要。此前研究表明CFAP65突变与鸡、人、鼠的MMAF相关，但跨膜螺旋域突变导致的孤立轴丝缺陷尚待阐明。因此，研究人员旨在通过对近亲巴基斯坦家系的研究，明确CFAP65新型突变与MMAF的关联，扩展其突变及表型谱，为遗传诊断提供依据。该研究论文发表在《Basic and Clinical Andrology》。
为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：研究对象来源于一个近亲结婚的巴基斯坦家系，包含两名不育男性成员（II:3和II:5）及一名可育兄弟（II:1）。主要技术包括依据世界卫生组织（World Health Organization, WHO）指南的常规精液分析与苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin, H&E）染色形态评估；全外显子测序（Whole-exome sequencing, WES）结合桑格测序（Sanger sequencing）进行变异筛选与共分离验证，利用ANNOVAR及基因组分析工具包（Genome Analysis Toolkit, GATK）进行数据分析与纯合性片段（Runs of homozygosity）定位；扫描电子显微镜（Scanning electron microscopy, SEM）与透射电子显微镜（Transmission electron microscopy, TEM）观察精子超微结构；以及运用MutationTaster2和Franklins ACMG等工具进行变异致病性的生物信息学（In silico）分析。
研究结果部分如下：
Identification of a novel homozygous CFAP65 frameshift mutation in a consanguineous Pakistani family。研究人员对一个近亲巴基斯坦家系进行全外显子测序及桑格测序验证，在两名不育兄弟（II:3和II:5）中鉴定出CFAP65第4外显子新型纯合移码变异c.582_587delinsCG（p.Q194Hfs*4），该变异导致第194位谷氨酰胺被组氨酸取代并在第197位引入提前终止密码子，预测产生截短蛋白。自身免疫性定位（Autozygosity mapping）确认变异位于共享纯合区域，符合常染色体隐性遗传，变异在未受累家系成员中缺席且未见于人群数据库（gnomAd和1000genome），经ACMG指南评估为可能致病。两名患者染色体核型正常（46, XY），无Y染色体微缺失，生殖激素正常，精液量及浓度正常但活力显著下降（分别为10±1.16和18.67±2.6），无原发性纤毛运动障碍（Primary ciliary dyskinesia, PCD）症状及胸部X线异常。
CFAP65 mutation underlies MMAF-associated asthenozoospermia。研究人员通过H&E染色发现患者形态正常精子比例极低（P1为3.07±0.07%，P2为2.67±0.33%），超过97%精子呈现鞭毛卷曲、短小、弯曲、不规则及缺失等MMAF特征。SEM显示患者精子鞭毛缩短、卷曲、弯曲或缺失。TEM显示对照精子具正常“9+2”轴丝排列（包括微管双联体（Doublet microtubules, DMTs）、中央微管对（Central pair, CP）、外致密纤维（Outer dense fibers, ODFs）、纤维鞘（Fibrous sheath, FS）、内臂动力蛋白（Inner dynein arm, IDA）及外臂动力蛋白（Outer dynein arm, ODA）），而患者P2精子轴丝严重解体，85%横切面见DMTs缺失或破坏，且顶体（Acrosome）保留，表现为孤立的轴丝缺陷，区别于既往报道的伴顶体发育不全的CFAP65突变表型。
讨论部分总结：研究人员指出MMAF遗传病因约40%至50%尚未明确，本研究在巴基斯坦近亲家系中发现CFAP65新型纯合移码突变（c.582_587delinsCG），证实其呈常染色体隐性遗传。TEM揭示该位于跨膜螺旋域（187-209 aa）的突变导致选择性轴丝微管双联体解体而无顶体缺陷，提示CFAP65具域特异性功能：跨膜螺旋域对轴丝完整性至关重要，而其他区域可能调控顶体发育。CFAP65作为支架蛋白参与顶体锚定及尾管复合体运输，其跨膜域对基体外接及多纤毛发生中F-肌动蛋白富集关键，但其在轴丝组织中具体作用尚待阐明。尽管CFAP65在多种纤毛组织表达，本患者无呼吸道等肝外症状，小鼠敲除模型亦未见呼吸纤毛显著受损但有脑积水及MMAF，提示该突变可能主要为精子特异性表型，不排除亚临床纤毛功能障碍。本研究扩展了CFAP65突变及表型谱，强调突变位点对预测表型的意义，为近亲群体精准诊断提供框架，未来需进一步解析CFAP65调控鞭毛组装机制及其在纤毛功能中的潜在作用。
结论部分翻译：本研究鉴定出CFAP65基因中的一种新型纯合移码突变，该突变导致两名不育兄弟发生MMAF。该突变破坏了蛋白质的跨膜结构域，导致孤立的轴丝解体而无顶体缺陷。这凸显了CFAP65的域特异性功能，其中该区域对鞭毛完整性至关重要。研究结果扩展了MMAF的遗传和表型谱，强调了突变位置在预测临床结果中的重要性，为改进诊断及未来研究CFAP65在纤毛功能中的作用提供了基础。
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