《Chinese Medicine》：Wendan decoction modulates Parasutterella to influence fatty acid metabolism in MAFLD via the FXR/PPARα/CYP4A12A axis
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背景 宿主肠道菌群和肝脏药物代谢酶是中药成分代谢和生物效应的重要介质。通过双向相互作用，中药也能重塑宿主微生物群落。温胆汤（WDD）治疗代谢功能障碍相关性脂肪肝病（MAFLD）的临床疗效已得到充分证实。然而，其通过肠肝轴与宿主菌群的相互作用仍不清楚。目的 本研
背景 宿主肠道菌群和肝脏药物代谢酶是中药成分代谢和生物效应的重要介质。通过双向相互作用，中药也能重塑宿主微生物群落。温胆汤（WDD）治疗代谢功能障碍相关性脂肪肝病（MAFLD）的临床疗效已得到充分证实。然而，其通过肠肝轴与宿主菌群的相互作用仍不清楚。目的 本研究旨在探讨WDD通过肠肝轴调节宿主微生物活性以改善MAFLD的机制。方法 通过高脂饮食（HFD）喂养建立MAFLD模型，随后用WDD、Parasutterella excrementihominis（P. excrementihominis）或7α-OH-T处理。ABX组在治疗前接受抗生素介导的菌群清除。采用多组学分析表征菌群衍生代谢物的动态轨迹，包括血清靶向胆汁酸（BA）谱分析、盲肠内容物16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学、肝脏组织蛋白质组学和非靶向代谢组学。采用苏木精-伊红、油红O和阿利新蓝-过碘酸雪夫染色评估MAFLD期间肝脏和肠道组织的病理变化。通过ELISA、Western blotting等实验量化炎症和脂质代谢标志物。在通过UPLC/UV检测门静脉血清中7α-OH-T后，利用分子对接和分子动力学模拟，结合细胞热转变分析（CETSA）和微量热泳动（MST），验证FXR是7α-OH-T的靶点。结果 WDD减轻了MAFLD中的肝脏脂肪变性、肠道炎症和屏障功能障碍，但这些效应依赖于宿主菌群的完整性。16S rRNA基因测序显示WDD促进了有益菌（包括Bacteroides和Parasutterella）的生长。血清靶向BA代谢组学和盲肠内容物非靶向代谢组学的联合分析表明，WDD介导的宿主菌群调节降低了血清总BA负荷，增加了肝脏和肠道中替代途径代谢物（包括CDCA和TCDCA），并减少了有毒次级BA（包括DCA和LCA）。类固醇和脂肪酸代谢物（如7α-OH-T）也增加。Pearson相关分析和P. excrementihominis移植实验提示7α-OH-T的增加与P. excrementihominis密切相关。肝脏非靶向代谢组学和血清学分析证实，肠道来源的7α-OH-T通过门静脉进入肝脏，并通过肠肝轴作用于肝脏靶点。在外源性7α-OH-T补充的动物实验和7α-OH-T处理的MAFLD THLE-2细胞模型中，7α-OH-T改善了肝脂质积累并促进了THLE-2细胞中的脂质利用。一系列相互作用实验（包括CETSA和MST）确定了FXR是7α-OH-T的靶点。此外，7α-OH-T显著激活了FXR/PPARα/CYP4A12A轴，并作为WDD介导的Parasutterella调节通过肠肝轴缓解MAFLD的关键信使。结论 WDD增加了P. excrementihominis的丰度以及潜在相关代谢物7α-OH-T的水平。通过门脉循环，7α-OH-T促进了肠肝串扰并靶向FXR/PPARα/CYP4A12A轴，从而改善MAFLD。
**论文解读**
**研究背景与问题**
代谢功能障碍相关性脂肪肝病（MAFLD）是全球最常见的慢性肝病之一，其患病率持续上升，中国患者数量预计在2030年将超过3.1亿。MAFLD的疾病谱从单纯性肝脂肪变性进展至代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎、肝纤维化，乃至肝细胞癌（HCC）。其发病机制涉及脂肪酸氧化（FAO）受损、胆汁酸（BA）代谢紊乱和炎症反应等多个过程。近年来，肠道菌群作为宿主代谢和MAFLD进展的关键调节因子受到广泛关注，MAFLD患者常出现肠道菌群失调，其特征为菌群多样性降低、有益菌减少和有害菌富集，且这种失衡与肝脂肪变性程度正相关。肠道菌群失调与肠肝循环中断及BA代谢异常密切相关，特定肠道微生物将初级BA转化为高毒性次级代谢物，通过门静脉进入肝脏，进一步加重肝脂肪变性和炎症。因此，针对MAFLD的治疗策略不仅需要关注肝脏代谢，还应调节肠道菌群并重塑菌群-BA-FAO代谢轴。温胆汤（WDD）作为治疗痰证（与脾胃不和及气机紊乱相关）的经典方剂，已被证实对MAFLD等代谢疾病有效，但其通过肠肝轴与宿主菌群的相互作用机制尚不清楚。
**研究目的与内容**
研究人员旨在探究WDD通过肠肝轴调节宿主微生物活性以改善MAFLD的分子机制。研究假设WDD通过重塑宿主菌群、恢复BA和脂肪酸代谢稳态、改善肠肝功能来缓解MAFLD。为此，研究人员整合了多组学分析（包括16S rRNA基因测序、盲肠内容物非靶向代谢组学、血清靶向BA代谢组学、肝脏蛋白质组学和非靶向代谢组学），并结合单菌移植和代谢物补充实验，在微生物和代谢水平上阐明WDD的治疗机制。
**主要技术方法**
研究采用的关键技术方法包括：16S rRNA基因测序（V3-V4区，用于分析小鼠盲肠内容物菌群组成）；靶向胆汁酸代谢组学（AB Sciex QTRAP 5500系统，用于血清BA谱分析）；非靶向代谢组学（Waters ACQUITY UPLC I-Class Plus系统耦合Thermo Q Exactive HF质谱仪，用于盲肠内容物和肝脏代谢物分析）；肝脏蛋白质组学（DIA-NN软件分析，用于差异表达蛋白鉴定）；分子对接与分子动力学模拟（GROMACS 2023.2，用于评估7α-OH-T与FXR的结合）；细胞热转变分析（CETSA）和微量热泳动（MST）（用于验证FXR为7α-OH-T的靶点）。样本来源包括C57BL/6J小鼠（由江苏青龙山生物技术有限公司提供）和THLE-2细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）。
**研究结果**
**1. WDD对MAFLD小鼠肝脂肪变性和肠黏膜屏障损伤的逆转依赖于宿主菌群的完整性**
通过高脂饮食（HFD）诱导MAFLD小鼠模型，研究人员发现WDD（高剂量）能显著改善肝脏外观（从棕白色转为红润）、减少肝细胞炎症浸润和气球样变性、降低脂质沉积面积（油红O染色显示超过60%的脂质沉积被有效减少）、降低血清肝损伤标志物ALT和AST水平，并改善血脂谱（HDL升高、LDL和TG降低）。同时，WDD减轻了肠道炎症（IL-6、IL-1β、IL-18水平降低）、恢复紧密连接蛋白Occludin表达、改善酸性黏蛋白分泌失衡。然而，在抗生素（ABX）清除宿主菌群后，WDD的上述保护效应显著减弱，提示WDD的疗效依赖于宿主菌群的完整性。
**2. WDD重塑MAFLD小鼠肠道脂质、胆固醇和BA代谢**
盲肠内容物非靶向代谢组学分析显示，WDD处理显著改变了肠道代谢物谱，主要差异代谢物为脂质和脂质样分子，特别是脂肪酸酰基类、异戊二烯脂类以及类固醇和类固醇衍生物。KEGG富集分析表明，初级BA生物合成、类固醇激素生物合成和脂肪酸降解等通路在WDD治疗后显著富集。进一步分析表明，WDD降低了血清总BA负荷和有毒次级BA（如LCA和DCA）水平，同时增加了有益替代途径代谢物（如CDCA和TCDCA）在肝脏和肠道的水平。肝脏蛋白质组学与代谢组学联合分析显示，WDD调节了BA合成关键酶（CYP7A1、CYP7B1）的表达，部分恢复了BA合成功能。
**3. WDD调节MAFLD小鼠肠道菌群多样性和组成**
16S rRNA基因测序显示，WDD提高了MAFLD小鼠菌群的α多样性（ACE指数），部分纠正了菌群结构（PCoA分析）。在门水平，WDD降低了Firmicutes/Bacteroidota比值（与慢性炎症和肥胖相关）。在属水平，LEfSe分析揭示WDD显著富集了Bacteroides和Parasutterella等有益菌属。
**4. 多组学联合分析鉴定Parasutterella和7α-OH-T为WDD改善MAFLD的关键肠道来源候选物**
通过整合盲肠内容物代谢组学和16S rRNA基因测序数据的相关性分析，研究人员发现7α-羟基睾酮（7α-OH-T）等类固醇代谢物与Parasutterella丰度呈显著正相关。Pearson相关分析显示，7α-OH-T与炎症、纤维化和血脂指标呈负相关，提示其具有潜在肝保护和降脂作用。
**5. WDD通过协调类固醇分解、BA合成和FAO恢复MAFLD肝脏代谢稳态**
肝脏蛋白质组学分析显示，WDD显著上调了脂肪酸降解、PPAR信号通路和胆汁分泌等通路相关蛋白。GO富集分析表明，“对脂质的细胞反应”和“脂质生物合成过程的负调控”是关键生物学过程。PPI网络分析显示，CYP4A12A和CYP4A12B（调控脂肪酸代谢）处于网络中心位置，其在模型小鼠中表达受抑制，WDD处理后上调。此外，WDD还上调了BA合成关键酶（CYP7B1、CYP8B1）并下调了类固醇合成限速酶CYP11A1，表明WDD通过抑制类固醇合成、促进胆固醇水解以提供BA合成前体，从而恢复BA合成-分泌-脂解稳态。
**6. Parasutterella移植证实其通过肠肝轴重塑肝脏脂质代谢的因果作用**
选择Parasutterella代表种P. excrementihominis进行单菌移植实验。在抗生素清除宿主菌群前后，研究人员发现P. excrementihominis移植能改善MAFLD小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。肝脏非靶向代谢组学显示，P. excrementihominis显著改变了脂质代谢物谱，特别是脂肪酸酰基类。重要的是，P. excrementihominis移植增加了肝脏中7α-OH-T的水平。
**7. Parasutterella通过调节肝脏脂质代谢和肠道屏障功能改善MAFLD**
病理学检测显示，P. excrementihominis移植显著减少了肝细胞气球样变、炎症浸润和脂质积累（超过50%）。分子机制研究显示，P. excrementihominis增强了经典和替代BA合成途径（上调CYP7A1、CYP8B1、CYP7B1、BSEP），并激活了FXR/PPARα/CYP4A12A轴以及FAO相关蛋白（ACOX1、CPT1A、CPT2）的表达。同时，P. excrementihominis通过激活肠道FXR，上调了紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，改善了肠道屏障功能。
**8. 7α-OH-T通过FXR/PPARα/CYP4A12A轴改善MAFLD中的脂质沉积**
分子对接和分子动力学模拟显示，7α-OH-T与FXR结合稳定（结合能-8.9 kcal/mol）。CETSA和MST实验证实了7α-OH-T与FXR的直接结合（KD=2.10 μM）。在动物实验中，外源性7α-OH-T（10 mg/kg）显著减轻了肝脏脂质积累，并激活了FXR/PPARα/CYP4A12A轴及FAO相关蛋白表达。门静脉血清检测证实，7α-OH-T经肠道产生后通过门静脉进入肝脏。在THLE-2细胞MAFLD模型中，7α-OH-T在无毒浓度范围内（0.25-4 μM）减少了油酸诱导的脂滴积累，并促进了ACC2磷酸化、降低丙二酰辅酶A水平，从而加速脂肪酸氧化（FAO）。
**讨论与结论**
研究讨论指出，脂质代谢紊乱、BA信号异常、炎症激活和胰岛素抵抗相互作用形成MAFLD的复杂代谢病理生理网络，而当前治疗多针对单一环节且受限于个体差异和副作用。肠道菌群作为宿主代谢的上游调节因子，通过肠肝轴调控肝脏脂质代谢和炎症反应。本研究通过多组学分析、单菌移植和代谢物补充实验，揭示了WDD通过促进Parasutterella（特别是P. excrementihominis）的肠道定植，增加其相关代谢物7α-OH-T的水平，后者经门静脉进入肝脏，直接靶向FXR并激活PPARα/CYP4A12A轴，促进FAO，从而缓解MAFLD。研究结论为：WDD重塑了宿主菌群，特别是促进了Parasutterella的肠道定植，进而调节了与之密切相关的代谢物7α-OH-T。该代谢物通过肠肝轴经门静脉转运至肝脏，激活FXR/PPARα/CYP4A12A轴，促进肝细胞脂肪酸氧化，从而缓解MAFLD。本研究为WDD通过菌群-代谢物-宿主靶点轴介导的跨器官调控提供了分子基础，并鉴定了P. excrementihominis为具有BA和脂肪酸调节活性的菌株，以及7α-OH-T为降脂代谢物。论文发表在《Chinese Medicine》。
