《Chinese Medicine》：Pharmacological manipulation of Sema4D by salvianolic acid A mitigates diabetic retinopathy via inhibiting PlexinB1/RhoA/ROCK/pMLC2 signaling cascade involved in endothelial dysfunction
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背景：糖尿病视网膜病变（DR）是导致失明的主要原因。虽然抗血管内皮生长因子（VEGF）疗法有效，但其应用受限于患者反应差异和频繁注射需求。因此，确定DR的新治疗靶点至关重要。新证据表明，星形胶质细胞在DR内皮功能障碍中发挥作用，提示靶向星形胶质细胞-内皮细胞串
背景：糖尿病视网膜病变（DR）是导致失明的主要原因。虽然抗血管内皮生长因子（VEGF）疗法有效，但其应用受限于患者反应差异和频繁注射需求。因此，确定DR的新治疗靶点至关重要。新证据表明，星形胶质细胞在DR内皮功能障碍中发挥作用，提示靶向星形胶质细胞-内皮细胞串扰是一种有前景的治疗策略。目的：评估丹酚酸A（Sal A）对DR的治疗潜力，阐明其调节星形胶质细胞-内皮细胞相互作用的分子机制，并开发基于脂质体的纳米递送系统以增强其疗效。研究设计：研究人员使用链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠模型，并结合一系列体外和分子方法（包括共培养模型、转录组分析和靶点验证实验）系统研究了Sal A的保护作用和机制。方法：研究人员通过免疫荧光染色和伊文思蓝渗漏实验评估了体内视网膜血管结构和屏障功能。通过伤口愈合、Transwell迁移、管形成和球体发芽实验检测了体外内皮细胞行为。通过RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析。通过基于质谱（MS）的药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）筛选、细胞热转变分析（CETSA）和微量热泳动（MST）鉴定并验证了Sal A的直接靶点。通过蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定（ELISA）和实时定量PCR（qRT-PCR）检测了关键信号分子的表达。制备了脂质体@Sal A并表征了其理化性质（动态光散射、透射电子显微镜）、稳定性以及体内外疗效。结果：Sal A治疗改善了糖尿病小鼠的视网膜血管异常，表现为VE-cadherin和NG2表达增加，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达减少，以及无细胞毛细血管形成减少，共同恢复了血管完整性。机制上，星形胶质细胞来源的可溶性Semaphorin 4D（sSema4D）通过PlexinB1/RhoA/ROCK/pMLC2信号级联促进了内皮过度激活。Sal A直接结合星形胶质细胞上膜结合Sema4D的Arg92残基，显著抑制了sSema4D的脱落及其对内皮细胞的后续有害效应。此外，在糖尿病小鼠中，脂质体@Sal A增强了视网膜药物递送，并显示出比游离Sal A更优的治疗效果。结论：Sal A通过结合星形胶质细胞Sema4D的Arg92位点，抑制sSema4D脱落及下游PlexinB1/RhoA/ROCK/pMLC2信号，从而调节星形胶质细胞-内皮细胞串扰，保护DR中的视网膜血管结构和功能。脂质体封装显著增强了Sal A的治疗效果，使其成为DR治疗的有前景的候选药物。
**论文解读**
**研究背景与问题**：糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是工作年龄人群失明的主要原因。据统计，2020年全球约有1.031亿成年人患有DR，预计到2045年将增至1.605亿，其中4482万人将出现视力问题。DR的病理特征以内皮细胞（ECs）功能障碍为核心，表现为早期周细胞丢失、血管渗漏、无细胞毛细血管形成，以及晚期视网膜缺血，最终导致过度新生血管形成。尽管抗血管内皮生长因子（VEGF）疗法在临床中广泛应用，但患者反应差异大、需频繁注射，且部分患者仍会进展至失明。因此，深入探究DR发病机制、寻找新靶点及有效治疗策略具有重要临床和社会意义。近年研究揭示，视网膜星形胶质细胞在DR中通过分泌可溶性因子驱动ECs功能障碍，靶向星形胶质细胞-ECs串扰可能成为DR治疗的新方向。丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的主要水溶性活性成分丹酚酸A（Sal A）已被报道具有血管保护、抗氧化和神经保护活性，但其在DR中的具体作用及机制尚不明确。
**研究目的与结论**：本研究旨在评估Sal A对DR的治疗潜力，阐明其调节星形胶质细胞-ECs相互作用的分子机制，并开发脂质体纳米递送系统（脂质体@Sal A）以增强疗效。研究结论表明，Sal A通过直接结合星形胶质细胞膜上Semaphorin 4D（Sema4D）的Arg92残基，抑制可溶性Sema4D（sSema4D）的脱落，进而阻断下游PlexinB1/RhoA/ROCK/pMLC2信号级联，恢复ECs功能和血管完整性。脂质体封装显著提升了Sal A的视网膜递送效率和治疗效果，使其成为DR治疗的有前景候选药物。该研究发表于《Chinese Medicine》。
**主要关键技术与方法**：研究人员采用链脲佐菌素（STZ）诱导的C57BL/6J糖尿病小鼠模型（来源：SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.），结合SVG p12星形胶质细胞系和HUVECs/人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）进行体外实验。关键技术包括：基于药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）结合质谱（MS）进行靶点筛选；细胞热转变分析（CETSA）和微量热泳动（MST）验证结合；RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析；动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）表征脂质体@Sal A的理化性质；微流控芯片共培养模型模拟星形胶质细胞-ECs串扰。
**研究结果**：
1. **Sal A减轻STZ诱导的DR视网膜血管病理功能障碍**：通过免疫荧光染色（CD31、IB4、VE-cadherin、NG2、α-SMA）和伊文思蓝渗漏实验，研究人员发现Sal A（10 mg/kg）显著减少无细胞毛细血管形成、恢复VE-cadherin连续性、增加周细胞覆盖（NG2阳性）、降低α-SMA表达，并改善血管屏障功能，效果与临床抗VEGF药物贝伐珠单抗相当。
2. **Sal A逆转星形胶质细胞介导的ECs过度激活表型**：利用ibidi共培养系统和条件培养基（CM）实验，研究人员发现缺氧星形胶质细胞CM促进ECs迁移、管形成和球体发芽，而Sal A（4 μM）预处理星形胶质细胞后，CM显著抑制ECs的迁移、血管生成和F-actin富集，且Sal A对ECs无直接作用，提示其通过调节星形胶质细胞-ECs串扰发挥作用。
3. **Sal A修复星形胶质细胞触发的内皮屏障破坏**：RNA-seq分析显示，Sal A处理上调了与黏附连接（AJs）和紧密连接（TJs）相关的基因（如CDH5、CLDN5、TJP1）。蛋白质印迹和免疫荧光证实Sal A恢复VE-cadherin、ZO-1和Claudin-5表达，减少F-actin突起。Transwell通透性实验和微流控芯片共培养模型表明，Sal A预处理星形胶质细胞后，ECs屏障功能显著改善（FITC-dextran渗漏减少，跨内皮电阻值升高）。
4. **星形胶质细胞来源的sSema4D驱动ECs的侵袭性生物学事件**：DARTS-MS鉴定Sema4D为Sal A的直接靶点。ELISA和蛋白质印迹显示，Sal A剂量依赖性地降低缺氧诱导的sSema4D分泌，同时增加膜结合Sema4D水平。重组Sema4D刺激ECs可增强迁移、管形成和球体发芽，而Sema4D敲除星形胶质细胞CM失去促ECs活化作用，且Sal A对sSema4D的直接中和无效果，表明Sal A通过抑制Sema4D脱落发挥作用。
5. **Sal A通过直接结合Sema4D的Arg92残基阻止sSema4D脱落**：分子动力学模拟、CETSA、MST和DARTS实验证实Sal A直接结合Sema4D蛋白，且结合位点为Arg92残基。Arg92突变为Gly（R92G）后，Sal A与Sema4D的结合能力丧失，且无法降低sSema4D水平，证明Arg92是Sal A发挥功能的关键残基。
6. **Sema4D通过激活RhoA/ROCK2/pMLC2信号破坏内皮完整性**：重组Sema4D刺激ECs上调RhoA、ROCK2和pMLC2表达，降低VE-cadherin、Claudin-5和ZO-1水平，增加MYO10表达。ROCK抑制剂法舒地尔可逆转这些效应，表明Sema4D通过RhoA/ROCK2/pMLC2通路破坏内皮连接。
7. **Sal A通过抑制sSema4D/PlexinB1/RhoA/ROCK/pMLC2信号增强内皮功能**：沉默PlexinB1（Sema4D受体）可消除Sema4D诱导的ECs迁移、管形成和pMLC2上调。Sal A预处理星形胶质细胞后的CM显著降低ECs中RhoA、ROCK2和pMLC2水平。RhoA激活剂水仙环素可逆转Sal A的保护作用，而法舒地尔协同增强，证实Sal A通过抑制该信号级联保护内皮屏障。
8. **脂质体@Sal A的制备与表征**：通过薄膜水化-超声法制备脂质体@Sal A，平均粒径为138 nm，PDI为0.227，Zeta电位为-8.43 mV，包封率（EE）为41.66%，载药量（DL）为2.99%。稳定性试验显示30天内粒径稳定。LC-MS/MS分析表明，脂质体@Sal A组视网膜Sal A浓度显著高于游离Sal A组，且血浆药代动力学显示可接受的代谢稳定性。
9. **脂质体@Sal A显著减轻STZ诱导的DR血管功能障碍**：体内实验显示，5 mg/kg脂质体@Sal A静脉注射显著减少无细胞毛细血管数量、降低α-SMA阳性面积、改善血管渗漏，效果优于等剂量游离Sal A，表明脂质体封装增强了药物疗效。
**讨论与结论**：研究人员指出，Sal A通过直接结合星形胶质细胞膜Sema4D的Arg92残基，抑制sSema4D脱落，进而阻断sSema4D/PlexinB1/RhoA/ROCK/pMLC2信号级联，恢复ECs功能，保护视网膜血管结构与功能。脂质体纳米递送系统显著提高了Sal A的视网膜积累和疗效，具有临床转化潜力。研究结论翻译如下：总之，本研究表明，Sal A能够延缓DR的进展，这与星形胶质细胞和ECs之间的相互作用密切相关。Sal A通过直接结合星形胶质细胞膜上的Sema4D，阻止Sema4D的脱落，从而通过抑制sSema4D/PlexinB1/RhoA/ROCK/pMLC2信号级联维持内皮功能。此外，利用纳米医学的进展，将Sal A与脂质体药物递送系统结合，显著增强了Sal A对抗DR发展的治疗效果。综上所述，研究结果阐明了Sal A作为改善DR中血管结构和功能的有前景的候选药物。
