一种用于新型微藻 Chlorococcum amblystomatis 工业化生产的两阶段培养策略

《Journal of Applied Phycology》：A two-stage cultivation strategy for the industrial production of the novel microalga Chlorococcum amblystomatis

　　

该研究针对实验室研究与实际应用之间的差距，提出了一种针对尚未充分研究的但具有工业相关性的绿藻门(Chlorophyta)微藻 Chlorococcum amblystomatis 的两阶段生长策略的工业规模验证。研究人员通过使用异养培养(heterotrophic)的生长物作为工业规模光自养反应器(photoautotrophic reactors)的接种物，该方法显著加速了放大过程。所提出的策略与传统流程相比，整体放大时间减少了约5.5倍，且未损害生产力或生化质量。在7-L台式发酵罐(fed-batch mode)异养条件下实现了70.96±0.35 g L?1的最大生物质浓度，代表了该微藻迄今为止报道的最高值。获得的生物质干重蛋白质含量为32.42±2.30%，在光自养条件下培养增至54.55±2.04%，多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)从总脂肪酸(total fatty acids, TFA)的50.12±3.27%增加至67.74±0.35%，其中α-亚麻酸(alpha-linolenic acid, ALA)为主要脂肪酸。相反，饱和脂肪酸(saturated fatty acids, SFA)含量(38.26±1.63% of TFA)在光养阶段降至22.37±0.02% of TFA。色素含量在光养阶段也显著增加，叶绿素(chlorophylls)从10.04±1.68升至44.91±5.11 mg g?1，类胡萝卜素(carotenoids)达到显著浓度，包括叶黄素(lutein)(5.34±0.10 mg g?1)、β-胡萝卜素(beta-carotene)(5.92±0.39 mg g?1)和新黄质(neoxanthin)(3.53±0.75 mg g?1)。在测试的工业光自养系统中，封闭管式光生物反应器(closed tubular photobioreactors, PBR)是 C. amblystomatis 培养的最合适配置，与开放跑道池(open raceway ponds, RWP)相比，实现了更高的生物质生产力、增强的蛋白质含量和色素积累。总体而言，该工作证明了一种可扩展、高效且节省时间的 C. amblystomatis 培养策略，支持其在工业生物技术应用中的潜力。

研究背景与意义

全球对食品、饲料和生物材料的需求增长加剧了自然资源的压力，传统农业面临水资源短缺和气候变化等环境问题。微藻生物质作为蛋白质、必需脂肪酸和天然色素的替代来源，提供了可持续发展的途径。微藻可在工业生物反应器中培养，避免与常规农业竞争淡水和耕地，且具有占地面积小的优势。然而，微藻的大规模工业生产仍受限于高运营成本，且从实验室培养到工业光生物反应器(photoautotrophic reactors)的放大过程是耗时、资源密集且复杂的，需要技术优化。传统的光自养放大具有挑战性，且依赖天气条件。虽然异养培养(heterotrophic cultivation)能实现高密度生长和精确控制，但光自养对于提升目标生物活性化合物如蛋白质和光合色素至关重要。Chlorococcum amblystomatis 是一种兼具光养和异养能力的淡水微藻，营养组成优良，具有工业潜力但尚未充分探索。本研究旨在验证一种两阶段培养策略，即利用异养培养物作为接种物进行工业光自养培养，以解决放大效率低的问题并提升生物质品质，论文发表于《Journal of Applied Phycology》。

主要关键技术方法

研究人员使用来自Allmicroalgae培养收藏的无菌 Chlorococcum amblystomatis 菌株AGF0066CA。比较了不同代谢机制下获得的接种体，包括在250-mL摇瓶异养培养和250-mL气泡柱光自养培养。两阶段策略中，异养阶段在7-L台式发酵罐(fed-batch mode)中进行，以葡萄糖为碳源；光自养阶段在工业规模的封闭管式光生物反应器(closed tubular photobioreactors, PBR, 2.6 m³)和开放跑道池(open raceway ponds, RWP, 28 m²)中进行，使用MNS培养基。生长评估通过干重(dry weight, DW)监测，计算比生长率(specific growth rate, μ)和体积生物质生产力(volumetric biomass productivity, P)。生化分析包括通过CHN元素分析估算蛋白质，Bligh and Dyer法提取脂质，气相色谱-质谱(GC–MS)分析脂肪酸甲酯(fatty acid methyl esters, FAME)，分光光度法测定叶绿素，高效液相色谱(HPLC)定量类胡萝卜素。统计采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey’s HSD检验。

研究结果

Trophic shift assay

研究人员进行了初步试验评估使用异养培养接种体在第二阶段光自养气泡柱反应器中的影响。结果显示，使用异养和光自养来源接种体的培养物在体积生产力(0.14±0.01 g L^?1 day^?1)、比生长率(0.24±0.03至0.27±0.02 day^?1)和生物质浓度(1.29±0.07至1.35±0.05 g L^?1)方面无统计学显著差异(p≥0.05)。表明异养条件下获得的接种体能快速适应光自养条件并有效接种而不损害生长性能。基于此，工业规模验证显示传统光自养放大需约66天，而异养路线仅需12天，整体放大时间减少5.5倍。

Two-stage cultivation strategy

异养阶段在台式发酵罐中实现极高密度，最大生物质浓度达70.96±0.35 g L^?1，体积生产力17.32±0.74至44.46±1.31 g L^?1 day^?1，比生长率2.09±0.11 day^?1。工业光自养阶段中，封闭管式光生物反应器(PBR)表现优于开放跑道池(RWP)，PBR最大生物质浓度1.47±0.16 g L^?1，体积生产力0.13±0.02至0.17±0.04 g L^?1 day^?1，比生长率0.21±0.03 day^?1，面积生产力13.23±1.88 g m^?2 day^?1；RWP生长受限或忽略不计。证明异养高密度接种能快速启动大规模光养系统。

Proximate composition

异养培养期间蛋白含量在第2天达峰值64.86±2.89%干重(dry weight, DW)，随后降至32.42±2.30% DW；转入光自养PBR后恢复至54.55±2.04% DW，增长22.13%。碳水化合物在光自养下显著降低，呈负相关。RWP生物质灰分较高(20.61±2.78% DW)因环境污染物和盐浓度相对升高。RWP脂质含量最低(7.99±2.42% DW)因光照不均和温度波动。

Fatty acids profile

异养条件下多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)占50.12±3.27%总脂肪酸(total fatty acids, TFA)，主要为C16:0(34.37±1.38%)和C18:2n?6(LA)；光自养下PUFA增至66.35±0.43至67.74±0.35% TFA，以C18:3n?3(ALA, 29.58±0.41至35.76±0.58%)为主，且n?3脂肪酸积累增加，n?6减少。异养未检测到ALA，光自养未检测到微量C20:1和C20:0的部分量化差异。PBR与RWP脂肪酸谱定性一致。

Pigments profile

异养生物质色素含量低(叶绿素10.04±1.68 mg g^?1)，光自养阶段显著恢复，PBR达44.91±5.11 mg g^?1叶绿素，RWP较低。PBR类胡萝卜素浓度高：叶黄素(lutein)5.34±0.10 mg g^?1，β-胡萝卜素(beta-carotene)5.92±0.39 mg g^?1，新黄质(neoxanthin)3.53±0.75 mg g^?1。RWP因光照分布和沉降问题色素积累较差。证实光自养阶段对光合色素复合物发育至关重要。

讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究在7-L发酵罐采用补料批次(fed-batch)模式实现的70.96±0.35 g L^?1是该物种最高报道值，虽低于Chlorella vulgaris但优于Scenedesmus rubescens，显示其异养潜力。研究表明C. amblystomatis能高效从异养转为光自养且无生长损害，支持两阶段策略可行性，类似Chlorella属研究结果。放大时间从66天缩至12天，降低污染风险与成本。工业系统中封闭管式光生物反应器(PBR)优于开放跑道池(RWP)，归因于水力条件、光分布及C. amblystomatis较大细胞尺寸(~15 μm)易在RWP沉降。生化上，光自养阶段蛋白恢复源于代谢重组，氮同化增强用于叶绿体发育；PUFA从n?6转向n?3主导（ALA为主），Σn?6/Σn?3比率有利健康；色素在PBR中高积累具营养与生物技术价值。该策略解决了生物量产率与品质的权衡问题。

结论部分翻译：该研究证明了 Chlorococcum amblystomatis 作为一种用于工业规模生物质生产的稳健微藻的巨大潜力。异养补料批次培养实现了极高细胞密度(70.96±0.35 g L^?1)，系该物种迄今最高值。重要的是，C. amblystomatis 能够快速从异养过渡到光自养生长而不损害性能，支持了使用异养条件下获得的浓缩接种体进入工业规模光自养反应器的两阶段培养策略的可行性。该方法显著减少了放大时间，并显著提高了该生物工艺的整体生产力。除工艺性能外，所得生物质显示出高价值的生化特征，表现为高蛋白含量、富含多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)的脂质部分，特别是必需PUFA α-亚麻酸(alpha-linolenic acid, ALA)，导致有利的Σn?6/Σn?3比率。此外，叶绿素的恢复以及叶黄素(lutein)、β-胡萝卜素(beta-carotene)和新黄质(neoxanthin)等类胡萝卜素的积累进一步增强了其营养和生物技术价值。重要的是，该工作通过在工业规模验证两阶段培养策略同时展示一种未充分探索但具工业相关性的微藻潜力，填补了实验室研究与工业应用之间的空白。总之，结果凸显了 C. amblystomatis 作为一种多功能且有前景的微藻，能够结合高效生物质生产与高价值生物分子合成。因此，提出的两阶段培养策略代表了一种用于食品、饲料和营养保健品应用的可持续工业富营养微藻生物质生产的有前途的方法。