阿立哌唑调节单次延长应激诱发的大鼠脾脏微生物群和免疫反应

《Pharmacological Reports》：Aripiprazole modulates splenic microbiota and immune response elicited by single prolonged stress in rats

　　

摘要
背景：创伤后应激障碍（PTSD）与下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴和交感-肾上腺髓质系统的失调相关，导致免疫失衡和微生物群组成的变化。应激诱导的肠道屏障完整性破坏可能促进细菌易位至外周器官，包括脾脏。阿立哌唑（ARI）是一种非典型抗精神病药，被提议用于PTSD治疗，同时也能调节免疫系统和微生物群。本研究在PTSD动物模型中探讨了ARI对脾脏微生物群组成以及脾脏神经内分泌和免疫反应的影响。
方法：研究人员将大鼠暴露于单次延长应激（SPS）范式以诱导PTSD样表型，并腹腔注射载体或ARI治疗28天。使用高架十字迷宫评估焦虑样行为。在离体刺激脂多糖（LPS）或佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）/离子霉素后，通过实时定量PCR（qRT-PCR）在分离的脾细胞中定量脾脏微生物群和基因表达。
结果：SPS和SPS+ARI降低了拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度。SPS增加了γ/δ-变形菌门（γ/δ-Proteobacteria）和乳杆菌属（Lactobacillus）的丰度，这些效应被ARI减弱。特定脾脏细菌的存在与焦虑样行为相关。虽然LPS诱导的反应未受影响，但来自SPS暴露大鼠的脾细胞在PMA/离子霉素刺激后表现出Th1和Th17相关基因表达增加；该效应被ARI逆转。
结论：ARI调节SPS诱导的脾脏微生物群改变，并减弱增强的Th1和Th17相关反应，从而有助于恢复免疫平衡。研究人员的发现强调了肠道-脾脏-脑轴在PTSD发病机制中的作用，以及阿立哌唑对脾脏免疫细胞的免疫抑制/微生物群调节作用。

**论文解读：阿立哌唑调节单次延长应激诱发的大鼠脾脏微生物群和免疫反应**

**研究背景与问题**

创伤后应激障碍（PTSD，一种在经历严重创伤事件后发展的精神疾病）与神经内分泌、免疫和微生物群的失调密切相关。现有研究指出，PTSD患者常表现出下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能紊乱，导致皮质酮/皮质醇水平异常，进而引发免疫调节不足和过度炎症。同时，应激诱导的肠道屏障受损可能促使细菌易位至脾脏等外周器官，而脾脏作为T淋巴细胞（特别是产生白细胞介素-17A（IL-17A）的Th17细胞）的重要来源，在PTSD相关免疫失调中扮演关键角色。非典型抗精神病药阿立哌唑（ARI）已被提议用于PTSD治疗，并显示出调节免疫系统和微生物群的潜力。然而，在单次延长应激（SPS）模型中，ARI对脾脏微生物群组成及脾脏神经内分泌和免疫反应的影响尚不清楚。因此，本研究旨在探究SPS诱导的PTSD样表型下，脾脏微生物群变化、神经内分泌功能及免疫反应，并评估ARI的调节作用。

**研究内容与结论**

研究人员采用雄性Sprague-Dawley大鼠，随机分为载体（VEH）对照组、SPS暴露组（SPS）和SPS+ARI治疗组（SPS+ARI），进行28天腹腔注射给药。通过高架十字迷宫（EPM）评估焦虑样行为，并检测血浆皮质酮水平、脾脏神经内分泌受体表达、脾脏细菌16S rRNA水平及脾细胞离体刺激后的基因表达。主要结论如下：ARI可调节SPS诱导的脾脏微生物群改变（如降低γ/δ-变形菌门和乳杆菌属丰度），并减弱增强的Th1和Th17相关免疫反应，部分恢复免疫平衡，提示脾脏在肠道-脾脏-脑轴中发挥整合作用。

**技术创新与关键方法**

本研究采用单次延长应激（SPS）范式建立PTSD样模型（大鼠依次经历2小时束缚、20分钟强迫游泳、15分钟恢复后暴露于乙醚蒸气直至意识丧失，随后14天静息期以发展症状）。通过高架十字迷宫（EPM）行为学测试评估焦虑样表型（记录开放臂停留时间和进入次数）。脾脏细菌16S rRNA水平使用实时定量PCR（qRT-PCR）检测（针对总细菌、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、γ/δ-变形菌门、乳杆菌属、瘤胃球菌属和普雷沃菌属）。脾细胞离体刺激采用脂多糖（LPS，10 μg/ml）或佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA，81 nmol/L）联合离子霉素（1.34 μmol/L）处理3小时，随后通过qRT-PCR检测炎症介质和细胞因子基因表达。血浆皮质酮水平通过酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测。所有数据采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）及Fisher’s LSD事后检验，非正态分布数据采用Kruskal-Wallis检验，相关性分析采用Pearson相关系数。

**研究结果**

**EPM测试**
SPS或SPS+ARI治疗对大鼠在开放臂停留时间或进入次数无显著影响（单因素ANOVA，p>0.05），表明两组焦虑样行为水平相似。

**脾脏应激反应与神经内分泌调节**
血浆皮质酮水平、糖皮质激素受体（GR）mRNA、β1-肾上腺素能受体（β1-AR）、α1B-AR、α2A-AR、酪氨酸羟化酶（TH）和胆碱乙酰转移酶（CHAT）mRNA表达在组间无显著差异。但β2-AR mRNA表达显著受处理影响（F_2,23=6.1，p=0.008），SPS组呈降低趋势（p=0.058），SPS+ARI组显著降低（p=0.002）。

**脾脏微生物群测定**
总细菌和厚壁菌门16S rRNA水平无组间差异。拟杆菌门水平显著降低（F_2,20=3.6，p=0.046），SPS和SPS+ARI组均低于VEH组（p分别为0.032和0.043）。γ/δ-变形菌门水平显著受处理影响（F_2,20=4.1，p=0.032），SPS组增加（p=0.043），ARI减弱该效应（p=0.016）。乳杆菌属水平显著变化（F_2,20=3.5，p=0.048），SPS组增加（p=0.037），ARI抑制该效应（p=0.030）。放线菌门、瘤胃球菌属和普雷沃菌属无显著差异。

**脾脏免疫细胞标志物**
淋巴细胞抗原6复合体（LY6C）、共刺激分子分化簇80（CD80）、特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素受体1（SIGNR1）和趋化因子C-C基序配体21（CCL21）的mRNA表达在组间无显著差异。

**脾细胞离体LPS刺激**
LPS刺激显著增加环氧化酶-2（COX-2）、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNFα）、IL-12A、CCL2、IL-10和CD40的mRNA表达（p<0.001），但SPS/SPS+ARI处理及其交互作用均不显著。值得注意的是，IL-1β分析显示，LPS刺激仅在VEH和SPS+ARI组中显著增加，SPS组未达到统计学意义。

**脾细胞离体PMA/离子霉素刺激**
PMA/离子霉素刺激显著增加COX-2、IL-1β、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、CD69、IL-2、干扰素γ（IFNγ）、TNFα、IL-12受体β（IL-12Rβ）、IL-17A、信号转导与转录激活因子3（STAT3）和IL-4的mRNA表达（p<0.001）。关键发现包括：SPS组IL-1β反应与VEH相似，但SPS+ARI组显著减弱（p=0.006 vs VEH，p=0.022 vs SPS）。CD69表达在SPS组刺激后显著高于VEH（p=0.003）。IL-12Rβ仅在SPS组刺激后显著升高（p<0.001），且SPS组高于VEH（p=0.007），ARI预防了这一增加（p=0.017）。IL-17A刺激后仅在VEH和SPS组显著增加（p=0.016和p<0.001），SPS+ARI组无显著变化。STAT3在未刺激条件下，SPS+ARI组表达高于SPS组（p=0.024）。髓过氧化物酶（MPO）表达无显著变化。

**相关性分析**
厚壁菌门16S rRNA与血浆皮质酮正相关（r=0.5，p=0.0148）。开放臂停留时间与厚壁菌门（r=0.45，p=0.027）和放线菌门（r=0.53，p=0.0078）正相关；开放臂进入次数与拟杆菌门正相关（r=0.49，p=0.017）。血浆皮质酮与LPS刺激后IL-1β（r=0.58，p=0.014）和COX-2（r=0.63，p=0.0021）正相关。乳杆菌属16S rRNA与LPS刺激后COX-2正相关（r=0.5，p=0.028）。拟杆菌门16S rRNA与LPS刺激后IL-10正相关（r=0.57，p=0.018）。γ/δ-变形菌门16S rRNA与PMA/离子霉素刺激后GM-CSF（r=0.74，p<0.001）和IL-17A（r=0.57，p=0.018）正相关。CD69表达与α1B-AR（r=0.64，p=0.019）和TNFα（r=0.74，p<0.001）正相关。

**讨论与结论**

本研究首次在SPS模型中揭示脾脏微生物群、神经内分泌和免疫反应之间的协调变化，并证明ARI部分逆转这些效应。SPS降低脾脏拟杆菌门16S rRNA，增加γ/δ-变形菌门和乳杆菌属，而ARI抑制后两种变化。相关性分析提示脾脏细菌易位与焦虑样行为及全身应激反应相关。在免疫方面，SPS未增强脾细胞对LPS的反应，但通过PMA/离子霉素刺激揭示了Th1和Th17相关标志物的上调（如CD69、IL-12Rβ、IL-17A），而ARI减弱了这些增强反应（如IL-1β、IL-12Rβ、IL-17A）。结论部分指出：SPS在脾脏中诱导了与皮质酮水平、焦虑样行为和免疫活性密切相关的特定细菌类群改变，表明细菌易位至脾脏对压力相关结局具有功能意义。此外，SPS促进了促炎性Th1/Th17表型，而ARI部分减弱了该表型。总体而言，研究结果强调了脾脏在SPS模型中介导微生物群-免疫-神经内分泌串扰中的重要作用，为理解PTSD发病机制及ARI的免疫调节作用提供了新视角。