《Virus Genes》：Molecular characterization and recent spread of dengue virus type 3 lineage III_B.3.2 in Brazil: in silico analysis of protein motifs and epidemiology
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登革病毒（Dengue virus, DENV）属于黄病毒科（Flaviviridae）家族，是一种具有全球相关性的发热性虫媒病毒疾病病原体。在巴西，自上世纪以来四种病毒血清型呈地方性（endemic）循环，其中DENV-3常关联更严重的临床状况与重大流行。本
登革病毒（Dengue virus, DENV）属于黄病毒科（Flaviviridae）家族，是一种具有全球相关性的发热性虫媒病毒疾病病原体。在巴西，自上世纪以来四种病毒血清型呈地方性（endemic）循环，其中DENV-3常关联更严重的临床状况与重大流行。本研究旨在对巴西循环的DENV-3毒株进行基序（motif）表征及其流行病学分析。研究人员从DATASUS/TABNET获取2013年至2025年按血清型分列的病例信息。此外，分析了GenBank与GISAID数据库中可用的184条巴西样本完整基因组，以DENV-3参考基因组序列（NC_001475.2）为参照。序列使用MAFFT、BioEdit、Nextclade及GeneDoc软件进行编辑与分析以识别谱系与氨基酸基序，随后提交至IQ-Tree与FigTree程序进行系统发育分析。结果表明历史上血清型1占主导，但2024年DENV-2与DENV-3病例较上一年显著增加。截至2025年12月，当年DENV-3病例数已超越DENV-1。全基因组共鉴定出九个氨基酸基序，特别是N-豆蔻酰化（N-myristoylation）、酪蛋白激酶II（Casein kinase II）磷酸化、蛋白激酶C（Protein kinase C）磷酸化及N-糖基化（N-glycosylation）位点。2022年前主导谱系为3III_C.2与3III_C.2.2，彼时谱系3III_B.3.2被引入巴西，其与该病例增加相关。该基因型相较于先前谱系呈现取代及蛋白基序缺失，提示此类改变促成了其复制成功。
研究背景方面，登革热是由登革病毒（DENV，黄病毒科Flaviviridae成员）引起、经埃及伊蚊（Aedes aegypti）或白纹伊蚊（A. albopictus）传播的动物源性发热疾病，其基因组约为一万一千个核苷酸的正链单股RNA，编码三种结构蛋白（C、M、E）与七种非结构（NS）蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5），其中DENV-2与DENV-3常关联更严重病例。巴西自上世纪起四种血清型呈地方性循环，1980年代首次在罗赖马州记录DENV-1与DENV-4流行，2000年代起DENV-2与DENV-3出现增加了流行病学复杂性，热带亚热带气候、无序城市化与全球化助推了疫情。2025年2月泛美卫生组织（PAHO）就美洲DENV-3循环发出警报，指出人群因缺乏既往暴露而广泛易感且DENV-3可致重症；2024年血清型3重新兴起于巴西东南部并关联重症，而历史上DENV-1在2023年最常见，但2024年DENV-2与DENV-3显著增加，2025年12月DENV-3病例已超DENV-1。当前控制依赖灭蚊与疫苗接种（如Dengvaxia?、Qdenga?），但人口流动、气候变化与增长仍致高发，因此研究人员旨在对巴西历年DENV-3毒株进行分子表征并评估鉴定巴西样本氨基酸序列中的结构基序突变。
研究人员开展的研究基于2013年至2025年12月DATASUS/TABNET报告的巴西各州实验室确诊或临床流行病学诊断的登革病例数据，以及从GISAID与NCBI数据库筛选的184条巴西DENV-3完整编码序列（过滤条件为完整编码DNA序列、高覆盖度、完整采集日期、巴西地点、无缺失基因且长度≥8000核苷酸），以NC_001475.2为参考，使用MAFFT在线服务器比对，BioEdit v7.2.5校正读码框与移码，GeneDoc v2.7.000基于PROSITE模式识别蛋白基序与保守区，Nextclade v3.18.1进行谱系分类与质量评分，IQ-Tree在线服务器选用TIM2+F+I+G4模型并以1000次SH-aLRT与UFBoot进行最大似然（Maximum Likelihood）系统发育分析，FigTree v1.4.4观察系统发生树并以NC_001475.2重根。
研究结果部分，首先是病例数（Number of cases）：根据DATASUS数据，2014年至2025年12月巴西累计记录15,970,928例确诊登革病例，2024年为峰值（5,988,245例），东南部最高发，其次为南部、中西部、东北部与北部，主要受累人群为20–39岁，其次40–59岁与15–19岁；可分血清型中共343,139例，DENV-1占215,066例（62.67%），其次DENV-2（34.27%）、DENO-3（2.56%）、DENV-4（0.50%）；2024年DENV-3感染1,792例较2023年（106例）显著增加，2025年12月达6,766例超上年总量。
其次是DENV-3数据集分析（Analysis of the DENV-3 dataset）：基于参考基因组的184条序列多重比对识别出九个不同蛋白基序，其中酪蛋白激酶II（CK2）基序54次（19次在NS5内），蛋白激酶C（PKC）位点39次（9次在NS3），cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）位点10次（3次在锚定衣壳ancC蛋白），酪氨酸激酶磷酸化位点仅6次；N-豆蔻酰化位点55次（E与NS3各13次）；N-糖基化位点12个（E、NS5各3个，NS4B 2个，prM/pr、NS1、NS2A、NS3各1个）。Nextclade谱系分配显示参考序列属3III_A谱系；数据集中3III_B.3.2最常见（N=95），其次3III_C.2（N=58）、3III_C.2.2（N=28）及2003年单条3III_C.1；2014年前样本多属3III_C（除3V基因型），序列高度保守且共享多数基序。三条例外基因组（EPI_ISL_19179567等）在NS2A第1206aa处提前终止密码子致77.5%截断，Nextclade评为“mediocre”且质量分约61.1，属测序组装假象非生物学变异。最近序列NS5第2710aa处基序缺失可能源于2022年起新循环基因型，3III_B谱系具此改变且2024年米纳斯吉拉斯州一例同谱系的也缺失；第1433aa基序可能与宿主或局部循环有关。最大似然系统发育树显示两主要分支：基部分支（SH-aLRT/UFboot 94.9/100）聚集3III_C.1（N=1）、3III_C.2与3III_C.2.2（2001–2013年多区域）；2006与2007年两例3V基因型位于基部外支未分组，其差异为第691、1144、2072aa无N-豆蔻酰化，第944aa有CK2磷酸化，第1270与3105aa有肌酸磷酸激酶磷酸化，第2810aa无N-糖基化；上部分支为2023–2025年全国的3III_B.3.2谱系（分支支持100/100），暗示其进化与扩散成功。
讨论部分总结：比对中磷酸化基序多见于DENV-3非结构蛋白，或助病毒生物合成与免疫逃逸；PKC磷酸化位点在NS3与NS1较多（调控复制与多蛋白切割），PKC抑制反增复制；10个PKA磷酸化基序中3个在ancC，或改善C蛋白信号与切割以增强装配；CK2位点在NS5最多（19个），NS5有胞质（与NS3互作）与核型，DENV-2中NS5苏氨酸395的CK2磷酸化减核转运碍复制，丙肝病毒NS5A此磷酸化对复制必需，故推测这些基序对DENV-3复制成功有复杂调控。N-豆蔻酰化在E、NS5、NS3高频，或助靶细胞进入与复制复合物稳定（如DENV-2中NS3重分布脂肪酸合酶）；12个N-糖基化位点中E蛋白通常两个，糖基化后与prM互作折叠提毒力与感染性，NS1的N-糖基化稳蛋白促病毒出胞，这些基序参与病毒成熟与出胞。3III基因型自2000年代初巴西首疫来致最多病例，源于1960年代印度、1980年代斯里兰卡与非洲、1990年代拉美，从加勒比、哥伦比亚、委内瑞拉入巴西并区域多样化形成亚支；数据中3III_C.2、3III_C.2.2与3III_B.3.2为主，后者2023–2025出现印证2022年引入巴西；DENV-3超十五年低循环致人群免疫缺口（PAHO警示），3III_B.3.2在此易感背景下快速扩散反映进化轨迹与流行潜力。3V基因型分类曾争议（Lanciotti等归3I亚组，Nogueira等与Araújo等证其与亚洲1956–1980序列聚且不近他型而独立）。
结论部分翻译：在这项工作中，研究人员观察了巴西DENV-3的流行病学演变及该国分离序列中的结构基序。2022年3III_B.3.2谱系的出现导致DENV-3病例上升，引发流行担忧。该谱系与此前国内循环的谱系（3III_C.2与3III_C.2.2）特征相似，基序差异极少，除第1861aa与第2710aa位置外，这提示这些改变有利于该病毒在巴西的增殖。尽管如此，本研究受限于公共数据库沉积的样本、序列质量及所用工具；基因组监测完全依赖公共数据库沉积序列，可能因不同地区测序努力差异引入地理与时间采样偏差，潜在低估某些区域或暴发早期阶段；此外本研究为预测性表征且仅用计算分析，未来应进行体内研究以理解各血清型与基因型的特性并分析蛋白基序与结构对循环基因型的影响，从而预测与预防巴西DENV-3新流行。论文发表于《Virus Genes》。
