脓毒症诱导的内皮糖萼破坏与重塑：一项小鼠超微结构研究

《Intensive Care Medicine Experimental》：Sepsis-induced endothelial glycocalyx disruption and remodeling: an ultrastructural study in mice

　　

背景：脓毒症通过糖萼降解损伤内皮细胞，导致器官功能障碍。糖萼修复对于恢复至关重要，但潜在机制仍不清楚。鼠李糖硫酸酯（RS）是一种具有抗炎特性的硫酸化多糖，可能支持内皮糖萼修复。在本研究中，研究人员利用小鼠脓毒症模型探究了糖萼修复过程及RS的治疗潜力。方法：通过盲肠结扎穿刺（CLP）在雄性C57BL/6小鼠中诱导脓毒症。小鼠被分为RS组、对照组（CTL）和假手术组。RS组口服给予RS，而CTL组在CLP后未接受治疗。假手术组仅行开腹手术而不进行CLP。采用透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）及定量TEM分析评估内皮糖萼修复。通过定量实时聚合酶链反应（qPCR）评估肝脏和小肠组织中糖萼相关酶和炎症细胞因子的基因表达。结果：CLP后7天存活率在RS组（55%）显著高于CTL组（25%）。TEM和SEM显示，在CTL组中，内皮糖萼在CLP后长达72小时内仍保持破坏状态，但到两周时出现了代偿性再生并增厚，超过假手术组观察到的水平。相比之下，在RS组中，糖萼连续性在72小时内恢复，并在两周时正常化至与假手术组相当的水平。定量TEM分析支持CLP后糖萼的显著结构改变以及RS治疗后糖萼厚度向假手术水平正常化。定量实时PCR显示CLP后炎症细胞因子（IL-1_β、IL-6、TNF-α）显著升高，而RS治疗组中这些因子趋于降低。糖萼降解酶乙酰肝素酶和透明质酸酶的表达也观察到类似趋势，其表达在RS治疗后受到抑制。结论：电子显微镜允许详细观察脓毒症小鼠内皮糖萼的修复。RS促进了糖萼修复并减少了炎症，提示RS给药可能是维持脓毒症血管完整性的新型治疗策略。

脓毒症（sepsis）是一种由微生物感染引发的过度免疫反应导致的危及生命疾病，尽管临床治疗有所进步，死亡率仍高达20–40%。严重脓毒症常引起血管内皮损伤并导致器官功能障碍。内皮细胞表面覆盖着一层由多糖和糖蛋白组成的复杂结构——糖萼（glycocalyx），它在脓毒症期间结构退化，导致血管通透性增加、微循环障碍，进而促进器官功能衰竭。糖萼的修复对恢复至关重要，但其潜在机制尚不清楚。既往研究尝试通过外源性补充糖萼成分（如硫酸软骨素和透明质酸）促进损伤糖萼的重建，但尚无有效疗法进入临床。近年来，鼠李糖硫酸酯（rhamnan sulfate, RS）——一种来源于绿藻Monostroma nitidum的硫酸化多糖，具有抗炎特性——被证实可通过口服调节肠道菌群、改善肠道功能并调控全身炎症反应。研究人员的前期工作显示，在脂多糖（LPS）诱导的急性炎症模型中，预防性RS给药可减少血管渗漏、减轻器官损伤和炎症反应，并保护肺内皮糖萼；在ApoE基因敲除小鼠中，RS可改善血脂异常并减轻血管炎症。然而，RS在脓毒症发生后能否促进糖萼恢复尚不清楚。本研究旨在利用盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture, CLP）小鼠脓毒症模型，评估口服RS在损伤后给药的治疗效果，重点关注内皮糖萼随时间依赖的超微结构损伤与修复过程。该研究发表于《Intensive Care Medicine Experimental》。

主要关键技术方法：研究人员采用雄性C57BL/6小鼠，通过CLP诱导脓毒症（盲肠结扎距顶端1 cm，26号针头单次穿刺距顶端5 mm），术后皮下注射生理盐水补液。小鼠分为假手术组（仅开腹）、对照组（CLP后无处理）和RS组（CLP后24 h和48 h口服10 mg RS，之后每日口服5 mg至第14天）。利用透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）结合硝酸镧染色，在CLP后24 h、72 h和两周时观察肝脏和肾脏内皮糖萼的超微结构，并进行定量TEM分析（测量糖萼厚度和线性覆盖率）。通过qPCR检测肝脏和小肠中糖萼相关酶（乙酰肝素酶HPSE、透明质酸酶HYAL2、葡糖醛酸转移酶GlcAT）及炎症细胞因子（IL-1_β、IL-6、TNF-α、TGF-β）的mRNA表达。此外，利用ELISA和多重免疫分析测定血浆糖萼脱落标志物（syndecan-1和透明质酸）及细胞因子水平。

研究结果：
- 生存分析：CLP后7天存活率在RS组（55%，11/20）显著高于对照组（25%，5/20）（p=0.037），假手术组无死亡。
- 内皮糖萼修复的超微结构分析：TEM和SEM图像显示，假手术组小鼠肝脏和肾脏毛细血管内皮覆盖连续、厚实、苔藓状的糖萼层，硝酸镧染色呈电子密度高。CLP后24 h，对照组糖萼显著破坏、变薄，失去连续性，表面覆盖率降低，部分区域出现聚集块；SEM显示内皮表面糖萼颗粒脱落。72 h后，对照组仍呈连续性丧失，糖萼颗粒大小异质性显著。RS组在72 h时糖萼恢复连续性且增厚，SEM显示糖萼颗粒重新覆盖内皮表面，且颗粒比对照组更细小。两周后，对照组糖萼恢复连续性但厚度超过假手术组，提示代偿性再生和过度重塑；RS组糖萼结构正常化，与假手术组相当。定量TEM分析证实CLP后糖萼厚度出现异常时间依赖性变化，但线性覆盖率和超微结构连续性破坏，提示损伤后不规则聚集和重塑而非正常恢复；RS治疗在72 h和两周时显著将糖萼厚度向假手术水平调整，线性覆盖率虽无统计学差异但呈现改善趋势。
- 定量实时PCR（qPCR）：在小肠样本中，CLP后对照组IL-1_β和IL-6表达显著高于假手术组（P<0.05），RS组IL-1_β、IL-6和TNF-α表达趋于降低；糖萼降解酶HPSE、HYAL2及合成酶GlcAT在各组间无显著差异。在肝脏样本中，对照组HPSE和HYAL2表达趋于高于假手术组，RS组则趋于低于对照组；GlcAT和炎症细胞因子表达无组间差异。
- 血浆生物标志物和细胞因子：CLP后血浆syndecan-1和透明质酸水平显著升高，IL-6和TNF-α也升高，证实全身性内皮损伤和炎症激活；但RS治疗在分析时间点未显著改变这些循环标志物水平。

讨论部分总结：研究表明，CLP诱导的脓毒症小鼠内皮糖萼在24小时内出现显著破坏（变薄、失去连续性、碎片化），并持续至少72小时，直到两周时对照组出现过度修复性增厚，提示损伤后修复缓慢且易出现异常重塑。口服RS（损伤后24小时开始给药）与更早、更稳健的糖萼修复相关：72小时时糖萼恢复连续性和厚度，两周时超微结构正常化至假手术水平。SEM进一步证实RS组血管表面糖萼颗粒再生。这些发现表明RS可能促进糖萼修复，且其作用从既往预防内皮损伤扩展至脓毒症后促进修复。qPCR结果显示RS在小肠中抑制炎症细胞因子（IL-1_β、IL-6、TNF-α）表达，并趋于抑制糖萼降解酶（HPSE、HYAL2）表达，而肝脏中未观察到类似效应，提示RS主要通过调节局部肠道炎症而非全身性炎症发挥作用。RS的保护机制可能涉及口服后调节肠道菌群（如Mucispirillum schaedleri）以清除活性氧、减轻氧化应激引起的炎症，从而早期抑制炎症反应，防止糖萼持续损伤并促进早期修复，同时调节后续重塑过程。尽管RS未显著改变血浆循环标志物，但存活率提高支持其保护作用。研究结论：电子显微镜可评估脓毒症小鼠内皮糖萼的修复过程；观察显示糖萼脱落72小时内几乎无修复迹象，但第14天出现过度重塑；RS可能促进早期内皮糖萼修复并抑制后期过度重塑，其抗炎效应主要局限于肠道。这些结果可能为维持脓毒症血管完整性提供新的治疗策略基础。