光学基因组图谱揭示的环状染色体：端粒相关区域与参考基因组选择对结构变异解读的影响

《Chromosome Research》：Ring chromosomes uncovered by optical genome mapping: impact of telomeric-associated regions and reference genome selection on structural variant interpretation

　　

环状染色体（RCs）是罕见的结构变异，通常由两个染色体臂末端融合形成，常伴有末端缺失。RCs通过核型分析、荧光原位杂交（FISH）、染色体微阵列分析（CMA）以及更近期的光学基因组图谱（OGM）进行研究，后者可实现全基因组结构变异检测；然而，其准确性依赖于与参考基因组的比对以及结构变异（SVs）的适当过滤。本研究分析了两位先前已确定具有环状染色体3和18的患者（每个患者仅在一个染色体臂上存在末端缺失：3p和18q），通过OGM将数据比对至两个参考基因组（GRCh38/hg38和T2T-CHM13），并与一项包含这两名患者的平行研究中的长读长测序（LRS）结果进行比较。患者1的RC3在采用GRCh38/hg38分析时被误判为3号与19号染色体之间的易位。使用T2T-CHM13重新分析后正确识别了RC3，并显示完整的3q臂（包括端粒相关区域）得到保留，这一结果得到LRS确认。患者2的环状染色体18在采用GRCh38/hg38时仅于降低置信评分过滤阈值后才被识别，而T2T-CHM13则立即检测到RC18，且未涉及18p端粒相关区域。LRS因具有核苷酸水平分辨率而显示RC18中存在这些区域，与分析结果存在差异。文献中报道的约3,000个RCs中仅8个通过OGM解析，本研究新增两例使用不同参考基因组分析的病例，并强调该技术在RC表征中的优势与局限性。由于T2T-CHM13分析效果优于GRCh38/hg38（因其能解析先前无法获得的端粒区域），研究人员还探讨了哪些其他染色体可能更能从此方法中获益。

环状染色体（RCs）是罕见的结构变异，通常由两条染色体臂末端融合形成，常伴有末端缺失，其发生率约为1/50,000新生儿。RCs的形成机制包括：染色体臂末端发生端粒缺失后，细胞通过端粒酶合成新端粒、捕获姐妹染色单体或非同源染色体末端的端粒（后者形成易位），或通过环化形成环状染色体。当端粒或亚端粒区域部分丢失时，相似重复序列也可能导致染色体末端融合并环化。RCs患者表型受受累染色体、缺失大小及环状染色体不稳定性导致的继发性遗传改变影响，可表现为“环综合征”，包括生长障碍、智力障碍及轻度畸形。传统检测方法包括核型分析、荧光原位杂交（FISH）和染色体微阵列分析（CMA），而新兴技术如全基因组测序（WGS）和光学基因组图谱（OGM）能提供更全面的分析。OGM通过成像超长线性化DNA分子上特定基序（motif）的标记，与参考基因组比对以检测结构变异。参考基因组自2003年人类基因组计划以来不断更新，GRCh37/hg19和GRCh38/hg38由基因组参考联盟（GRC）发布，但存在未解析间隙（gap），特别是端粒、着丝粒等复杂区域。T2T-CHM13参考基因组于2022年由端粒到端粒（T2T）联盟发布，无间隙，覆盖了先前缺失的8%基因组（包括异染色质区域），为涉及端粒等重复序列的结构变异分析提供了更完整的参考。本研究旨在探讨不同参考基因组（GRCh38/hg38 vs T2T-CHM13）在OGM分析RCs中的差异，并评估端粒相关区域对结构变异解读的影响。

研究人员开展了什么研究，得出什么结论，有什么重要意义，论文发表在《Chromosome Research》？本研究纳入两名先前经经典细胞遗传学技术确定的环状染色体3和18患者，分别采集外周血提取超高分子量（UHMW）DNA，采用Bionano Genomics平台进行OGM分析（DLS标记、Saphyr芯片线性化成像、Bionano Solve软件v3.7组装及变异注释），分别比对GRCh38/hg38和T2T-CHM13参考基因组，并与同一队列进行的平行长读长测序（LRS，PacBio Revio系统，15-20 kb文库，比对T2T-CHM13）结果比较。研究发现：患者1的RC3在GRCh38/hg38下被误判为t(3;19)易位，而T2T-CHM13正确识别RC3并显示3q臂完整保留端粒相关区域，LRS确认。患者2的RC18在GRCh38/hg38需降低SV置信度过滤阈值才检测到，T2T-CHM13直接检测到但未显示18p端粒相关区域，LRS则发现18p端粒相关区域存在（位于端粒变异重复TVR(TAACCC)_n）。此外，通过分析所有染色体末端未标记区域大小，发现染色体6、8两端未标记区域大，染色体11、17、19的p臂和1、3、5、9、12、16、18的q臂未标记区域较大，均更受益于T2T-CHM13分析；而2、4、7、10、X染色体两端未标记区域小，GRCh38/hg38可能足以解析涉及它们的重排。本研究结论：T2T-CHM13参考基因组在解析涉及端粒相关区域的RCs中优于GRCh38/hg38，但OGM仍存在局限性（如无法检测单核苷酸变异、需新鲜血液样本、低水平嵌合体检测阈值为5%等），且细胞遗传学分析（核型）对于指导OGM分析至关重要。研究强调了参考基因组选择对RCs结构变异解读的关键作用，新增两例OGM解析的RCs病例，推动该技术在临床诊断中的应用。

**关键技术方法概述**：
本研究采用光学基因组图谱（OGM）和长读长测序（LRS）两种技术。OGM：从两名患者外周血（样本来源：Guilherme et al. 2011b, a）提取超高分子量（UHMW）DNA，经DLS（Direct Label and Stain）标记试剂盒标记，加载至Saphyr芯片线性化并成像，使用Bionano Solve软件v3.7进行从头组装（de novo assembly）和变异注释，分别比对GRCh38/hg38和T2T-CHM13参考基因组，通过Bionano Access软件v1.7报告和可视化结构变异。LRS：作为平行研究（国际人类环状染色体联盟ICHRC，Chong et al. 2025）的一部分，对15-20 kb文库在PacBio Revio系统测序，比对T2T-CHM13，使用pbsv和HiFiCNV算法进行SV和CNV检测，并通过Integrative Genomics Viewer (IGV) 2.4.14软件进行断点可视化。

**研究结果**：
**Patient 1**
通过OGM结合GRCh38/hg38分析，发现3p缺失的下游断点与19p区域连接，提示t(3;19)(p26.1;p13.3)易位。但核型分析显示为环状染色体3。进一步分析发现3q末端存在~60 kb未测序间隙/端粒区域，导致GRCh38/hg38分析中无法产生标签。改用T2T-CHM13参考后，OGM正确检测到RC3（含3p缺失），并确认3q臂完整保留端粒相关区域，断点位于3q29（201,097,227），与LRS结果吻合（3p断点差异2,136 bp，3q断点差异6,596 bp）。
**Patient 2**
OGM结合GRCh38/hg38分析时，在“推荐”SV置信度过滤下未检测到环状染色体，仅显示18q缺失；将过滤设为“所有”后，检测到RC18（含18q缺失），断点位于18p11.32（18,868）和18q21.33（61,642,239）。T2T-CHM13分析直接检测到RC18（断点18p11.32:172,612，18q21.33:61,845,252），且18p断点位于GRCh38/hg38已测序区域，提示无端粒相关区域参与。但LRS分析显示18p断点位于端粒变异重复TVR（TAACCC)_n，存在多个可能断点（推断约chr18:55,654），表明RC18中保留了18p端粒相关区域，与OGM结果存在差异（OGM与LRS的18q断点差异仅218 bp）。
**Size analysis of terminal unlabeled regions**
分析所有染色体末端至最近OGM标签的未标记区域大小，发现：染色体6和8两端未标记区域均较大，最受益于T2T-CHM13分析；染色体11、17、19的p臂及1、3、5、9、12、16、18的q臂未标记区域较大，涉及这些区域的重排可能受益；染色体2、4、7、10、X两端未标记区域小，GRCh38/hg38可能足以解析；近端着丝粒染色体（acrocentric chromosomes）短臂即使在T2T-CHM13中仍存在比对挑战，需谨慎分析。

**讨论与结论**：
讨论部分指出，参考基因组的选择是OGM分析RCs的关键。T2T-CHM13因无间隙且包含端粒序列，能解析涉及端粒相关区域的RCs，而GRCh38/hg38因端粒区域未测序或存在间隙，可能导致误判（如患者1的t(3;19)易位假象）或需降低过滤阈值（如患者2）。然而，OGM仍有局限性：需要超高分子量DNA（非储存样本）、无法检测单核苷酸变异、断点仅提供坐标范围而非核苷酸分辨率、低水平嵌合体（<5%）可能漏检。细胞遗传学分析（核型）对于指导OGM分析至关重要，若无核型提示，可能误信GRCh38/hg38结果。研究还指出，OGM在成本上具有优势，可与核型分析联合替代CMA和FISH用于RCs检测。
**研究结论翻译**：在本研究中，研究人员利用光学基因组图谱增强了对两个环状染色体的研究，并强调了选择最合适的参考基因组进行分析的重要性，特别是当结构变异涉及端粒或其他重复区域时。T2T-CHM13参考基因组对于RC3的检测至关重要，揭示了端粒相关区域的参与，而GRCh38/hg38和T2T-CHM13均能检测到RC18，尽管与最终的LRS结果存在差异。细胞遗传学分析对于准确分析RCs也至关重要。文献中报道的通过OGM研究的RC患者很少，本研究旨在将更多病例纳入该组，使用不同参考基因组分析，并强调该技术在RC表征中的优势和局限性。