《Conservation Genetics Resources》：Validation of salivary DNA extraction for non-invasive genetic sampling of Castor fiber birulai and assessment of DNA persistence on Salix turanica twigs
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对濒危的Castor fiber birulai开展遗传监测受到其隐蔽行为以及在水生环境中采集粪便样本所面临后勤挑战的限制。本概念验证性研究评估了从Salix turanica枝条取食痕迹中获取的唾液DNA，作为一种用于物种水平遗传检测的非侵入性来源的可行性。
对濒危的Castor fiber birulai开展遗传监测受到其隐蔽行为以及在水生环境中采集粪便样本所面临后勤挑战的限制。本概念验证性研究评估了从Salix turanica枝条取食痕迹中获取的唾液DNA，作为一种用于物种水平遗传检测的非侵入性来源的可行性。研究人员利用1只个体在受控救护环境中的条件，评估了在低温条件（< 10 °C）下取食后0–12 h时间序列中的DNA持续性。为降低由柳树树皮次生代谢物（例如单宁和多酚）导致的聚合酶链式反应（PCR）抑制，研究采用了以土壤为基础、针对抑制物去除而选择的DNA提取方案。线粒体细胞色素b（cytb）片段可在取食后0–10 h内采集的全部样本中成功扩增，而在12 h后扩增失败。Spearman秩相关分析显示，暴露时间与DNA浓度及DNA纯度之间均存在显著负相关关系。上述结果界定了在有利低温条件下野外采样的实际新鲜度阈值，并表明来源于取食痕迹的唾液可为这一濒危亚种的非侵入性遗传监测提供一种补充性的、物种特异性样本来源。
本文发表于《Conservation Genetics Resources》，是一项围绕新疆河狸亚种Castor fiber birulai非侵入性遗传监测方法建立所开展的概念验证研究。研究背景在于，濒危野生动物的种群遗传监测是制定保护策略的重要基础，但对于稀有、隐蔽且对干扰敏感的物种而言，获取高质量遗传样本一直是保护遗传学中的核心难题。传统侵入性采样如捕捉、麻醉后采集血液或组织，虽可获得较高质量DNA，却伴随应激、损伤及伦理风险。非侵入性遗传采样因此成为重要替代路径。对于半水栖哺乳动物而言，这一问题尤为突出：粪便常排泄于水体中，易发生稀释、流失和微生物降解；毛发样本则依赖被动陷阱，捕获率不稳定且维护成本较高。相比之下，取食痕迹表面的唾液DNA理论上具有可操作性，因为唾液中含有口腔上皮细胞和白细胞，可为遗传检测提供模板。然而，该类样本也面临明显障碍，尤其是柳属植物树皮富含单宁、多酚等植物次生代谢物，这些成分容易与DNA共提取并抑制聚合酶链式反应（PCR），从而降低扩增成功率。因此，针对河狸取食后枝条表面残留唾液DNA的保存时限、提取策略和扩增适用性，亟需形成标准化依据。
基于此，研究人员以新疆布尔根河狸国家级自然保护区野生动物救护中心内1只获救健康成年雌性个体为对象，在受控低温条件下，对Salix turanica枝条取食痕迹中的唾液DNA进行了验证。研究的核心目标包括三方面：其一，评估枝条表面唾液DNA的数量和质量；其二，明确其随暴露时间延长而发生的降解规律及线粒体细胞色素b（cytb）片段扩增成功情况；其三，提出一套可复现的、适用于该濒危亚种的取食痕迹来源唾液DNA采样方案。研究结论表明，在低温且相对有利的环境条件下，取食后0–10 h内的Salix turanica枝条取食痕迹能够稳定提供可用于物种水平鉴定的DNA模板；12 h后则无法再稳定扩增目标片段。该研究的重要意义在于为Castor fiber birulai提供了一种无需直接接触动物、可结合野外取食痕迹开展的补充性遗传监测途径，也为半水栖濒危兽类在传统粪便和毛发样本难以获得条件下的遗传检测提供了方法学参考。
在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键策略。样本来源为同一只救护个体在室外模拟河岸环境围栏中自然啃食Salix turanica枝条后留下的取食痕迹。实验按取食后时间梯度设置T0、T2、T4、T6、T8、T10和T12共7个时间点，每个时间点采集3个重复，同时设置完整枝条阴性对照、提取空白对照和PCR无模板对照（NTC）以监测背景DNA与流程污染。DNA提取采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit，以增强对类似腐殖酸污染物及植物来源抑制物的去除。随后对线粒体cytb基因375 bp片段实施PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳判断扩增结果；代表性阳性产物进一步接受双向Sanger测序，并利用BLASTn与GenBank参考序列比对确认物种来源。统计分析采用Spearman秩相关评估暴露时间与DNA浓度、纯度之间的单调关系，并在R 4.4.3中完成数据可视化和显著性检验。
Results
Data overview
研究共采集24份Salix turanica枝条样本，其中21份为7个取食后时间点的取食痕迹样本，每个时间点3个重复；另有3份完整枝条样本作为背景阴性对照。结果显示，提取空白对照、PCR无模板对照以及完整枝条对照均未检测到预期大小的375 bp cytb扩增条带，说明实验全过程质量控制有效，未见明显污染。来自不同时间点的4个代表性阳性PCR产物进一步进行了双向Sanger测序，所得序列均成功拼接为高质量片段。BLASTn比对结果表明，这些序列与GenBank中Castor fiber birulai的cytb序列具有≥99%的同源性，且E-value接近0。由此可确认本研究中获得的阳性条带来源于目标物种，而非植物DNA或环境来源的非特异性扩增产物。
Effect of exposure time on DNA quality and cytb amplification success rate.
研究结果显示，暴露时间对唾液DNA的数量、纯度及扩增成功率具有显著影响。DNA浓度自T0时的17.50 ± 0.70 ng/μL持续下降至T10时的4.37 ± 0.67 ng/μL，并在T12进一步降至1.17 ± 0.35 ng/μL。Spearman秩相关分析证实，暴露时间与DNA浓度之间存在显著负相关（ρ = ?0.991, p = 5.33 × 10
?18），与DNA纯度A260/280之间也存在显著负相关（ρ = ?0.732, p = 1.63 × 10
?4）。这表明随着样本在环境中暴露时间延长，DNA产量和质量均发生时间依赖性下降。
与此相一致，PCR扩增表现也随之下降。在0–10 h采样窗口内，所有样本均成功扩增出目标375 bp cytb片段，扩增成功率为100%；而在暴露12 h后，所有样本均未检测到目标条带，扩增成功率降为0%。该结果说明，在本研究所设定的低温救护环境中，取食痕迹中的唾液DNA存在明确的有效采样时限，且该时限可界定在10 h以内。
讨论部分指出，本研究首次针对Castor fiber birulai验证了取食痕迹来源唾液DNA用于物种水平鉴定的可行性。与粪便样本相比，该方法避免了半水栖动物因水中排泄造成的样本流失和降解问题；与毛发陷阱相比，则无需额外装置和持续维护。由于河狸取食痕迹数量较多、形态容易识别，现场采样具有较强实用性。此外，采用以土壤化学净化思路设计的DNA提取试剂盒，有助于克服Salix spp.树皮中单宁、多酚等PCR抑制物带来的技术障碍，从而使0–10 h内样本实现稳定扩增。研究同时强调，这一“0–10 h有效窗口”仅适用于低温、遮阴、相对有利的暴露条件，不应被直接视为普适性野外标准。高温、紫外线、降水、高湿以及水体接触均可能加速DNA降解或造成唾液残留冲刷，从而缩短可检测时间。研究还指出两项主要局限：其一，仅使用1只获救个体开展验证，个体间在年龄、健康状况、取食强度和行为上的差异可能影响唾液沉积量；其二，本研究仅采用线粒体cytb标记，因此只能支持物种水平确认，尚不能实现个体识别和群体遗传分析，后续仍需利用微卫星（microsatellite）或单核苷酸多态性（SNP）标记进行验证。
结论部分可译述为：基于本研究结果，野外工作人员应优先采集轮廓清晰、表面湿润且无明显干燥或灰尘覆盖的新鲜取食痕迹，尤其适合在低温和遮阴条件下的晨间巡查时段（08:00–12:00）开展。本文所述的耐抑制DNA提取方案有望提高非侵入性物种水平遗传检测的成功率。未来研究应进一步评估此类样本上微卫星或SNP标记的扩增效率与基因分型可靠性，再将该方法应用于个体识别和群体遗传分析。随着后续验证的推进，来源于取食痕迹的唾液DNA有望整合进取食痕迹调查、遗传检测和资源利用研究中，从而支持对冬季取食偏好及破碎化或跨境生境中重点监测区域的精细尺度分析。
