使用壳聚糖纳米颗粒作为免疫佐剂的蝰科蛇毒免疫

《International Journal of Peptide Research and Therapeutics》：Viperid Venom Immunization Using Chitosan Nanoparticles as Immunoadjuvant

　　

摘要目的：蝰科蛇毒难以中和；严重蛇咬伤中毒可能使用多达19支抗蛇毒血清，因此新型佐剂可能提高抗蛇毒血清的疗效。本研究旨在利用壳聚糖纳米颗粒作为免疫佐剂，开发针对四种具有医学重要性的哥伦比亚蝰科蛇毒（Lachesis acrochorda (La)、Bothrops asper (Bas)、Bothrops ayerbei (Bay) 和 Bothrops rhombeatus (Br)）的中和抗体。方法：通过离子凝胶法将四种蝰蛇毒加载到壳聚糖纳米颗粒中并包封，用作免疫佐剂。色谱法、电子显微镜、多分散指数和红外光谱证实了蛇毒的包封。结果：使用壳聚糖包封的蛇毒对兔进行免疫，研究人员发现其定性上比佐剂对照组（不完全弗氏佐剂和氢氧化铝作为佐剂）危害更小。结论：虽然用壳聚糖-蛇毒纳米颗粒获得的兔抗体与免疫对照组相比在抗体滴度（AT50s）上无显著差异，但它们显示出比对照组略好的中和效果。将壳聚糖纳米颗粒与蝰科蛇毒包封可能是增强中和抗体的有用方法和替代免疫佐剂。

蛇咬伤中毒每年影响全球约两百万人，导致至少81,000至138,000例死亡，在哥伦比亚等热带南美国家，蝰科蛇属（Bothrops）和枪蝰属（Lachesis）引起的咬伤事件尤为突出，是严重的公共卫生问题。现有抗蛇毒血清（antivenom）作为唯一有效疗法，但存在局限性：不良反应、低交叉效价，以及对不同物种（如Bothrops rhombeatus和Bothrops ayerbei）的中和所需浓度显著更高。因此，研究人员旨在开发新型免疫佐剂（immunoadjuvant）以提高抗蛇毒血清的中和效率。壳聚糖（chitosan）是一种天然多糖，具有生物可降解性、生物相容性、无毒性和免疫调节特性，已被用作纳米载体。本研究利用壳聚糖纳米颗粒（chitosan nanoparticles，CNPs）包封四种哥伦比亚医学重要蝰科蛇毒（Lachesis acrochorda，Bothrops asper，Bothrops ayerbei，Bothrops rhombeatus），通过离子凝胶法（ionic gelation）制备，并评估其作为免疫佐剂诱导中和抗体的潜力。该研究发表在《International Journal of Peptide Research and Therapeutics》。

主要关键的技术方法包括：采用离子凝胶法将蛇毒蛋白包封于壳聚糖-三聚磷酸钠（TPP）纳米颗粒中；通过高效液相色谱（HPLC）、扫描/透射电子显微镜（SEM/TEM）、动态光散射（DLS）测定粒径、Zeta电位和多分散指数（PdI），以及傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行理化表征；使用雌性新西兰白兔（n=3/组）进行13周皮下免疫，每周递增剂量（12.5至175 μg蛇毒混合液/兔），对照组使用不完全弗氏佐剂（IFA）和氢氧化铝；辛酸纯化IgG；ELISA测定抗体滴度（AT₅₀）；Western blot检测蛋白识别；小鼠（BALB/c，n=5/组）中和试验采用3倍半数致死剂量（3LD₅₀）预孵育15或20 mg纯化IgG，观察48小时存活率。蛇毒样本来自哥伦比亚考卡大学生物医学研究中心（CIBUC）和爬虫学与毒理学研究组（GIHT），蛇类来自哥伦比亚太平洋地区，大部分由农民捐赠。

**Venoms and Physicochemical Analysis of the Nanoparticles**：通过离子凝胶法制备的壳聚糖-蛇毒纳米颗粒（VNPs）和空白纳米颗粒（NPs）均呈阳离子特性（Zeta电位+7.4 mV），平均粒径85.1 nm，多分散指数≤0.5，包封效率达77.5%。扫描和透射电镜显示纳米颗粒呈纳米棒、量子点和纳米团簇形态，粒径<100 nm，与DLS结果一致。红外光谱（FTIR）证实蛇毒蛋白通过羧基与壳聚糖胺基的相互作用被吸附，特征峰（1537和1633 cm^-1）强度增加，表明包封成功。

**Chromatographic Analysis of VNPs**：HPLC分析显示，在0.15 mg/mL浓度下，四种蛇毒的平均包封率约为75%，部分蛋白峰在包封后消失或减弱。SDS-PAGE分析表明，被包封的蛋白分子量分布在15-75 kDa，与磷脂酶A₂（PLA₂）、金属蛋白酶（metalloproteinase）等临床重要蛋白家族一致。

**Electron Microscopy**：透射电镜（TEM）观察证实VNPs和NPs均为球形或类球形，平均直径<100 nm，形态均匀，符合理化参数。

**Infrared Spectroscopy**：FTIR光谱显示VNPs在1537和1633 cm^-1处吸收峰增强，归因于蛋白羧基与壳聚糖胺基的相互作用；1200和894 cm^-1处峰对应TPP的P=O和P-O-P基团，证实包封。

**Western Blot**：使用哥伦比亚（INS）和墨西哥（Antivipmyn Tri）商品化抗蛇毒血清进行Western blot，发现两者对37-100 kDa蛋白识别较强，对15-25 kDa蛋白识别较弱，且Lachesis acrochorda蛇毒被识别较差。相比之下，兔抗VNPs IgG能更灵敏地识别低丰度蛋白，尤其是15-75 kDa范围的蛋白，对应PLA₂、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等。

**Immunodetection Assays**：ELISA显示，兔抗VNPs IgG对四种蛇毒的中效识别浓度（AT₅₀）低于或相当于对照组（IFA+氢氧化铝），且优于商品化抗蛇毒血清（尤其是对Lachesis acrochorda）。兔抗VNPs IgG的识别曲线更平稳，对Bothrops属蛇毒识别更强，对Lachesis acrochorda识别较弱，与商品化血清趋势一致。

**Antibody Titers**：兔抗VNPs的AT₅₀值与对照组（IFA+氢氧化铝）无显著差异，但均低于商品化抗蛇毒血清（INS和Antivipmyn Tri）。所有抗体对Bothrops asper（Colombia和Mexico）蛇毒的识别最佳。需注意，商品化血清为马源F(ab)₂或IgG，与兔IgG蛋白浓度不同，直接比较不完全等效。

**Neutralization Tests**：小鼠中和试验表明，兔抗VNPs IgG（15 mg）可保护19/20小鼠（3LD₅₀挑战），而对照组保护17/20小鼠；使用20 mg时，抗VNPs IgG完全保护所有小鼠（20/20），对照组仅保护19/20。抗VNPs IgG对Lachesis acrochorda蛇毒的中和率为80%（4/5），对照组为60%（3/5）。虽Fisher精确检验无显著差异，但趋势显示抗VNPs IgG的中和效果更优。

讨论部分指出，壳聚糖纳米颗粒作为免疫佐剂，其安全性和免疫调节活性得到验证，VNPs在兔免疫中未引起局部皮肤损伤，而对照组出现皮肤肿块。尽管包封率未达100%，但包封的蛋白足以诱导有效的抗体反应。ELISA和Western blot结果显示，抗VNPs IgG能识别对照组未识别的低丰度毒素，可能归因于壳聚糖的缓释和抗原呈递增强。与商品化抗蛇毒血清相比，兔抗VNPs IgG对Lachesis属蛇毒的中和较弱，这与免疫原中Lachesis毒液占比低及免疫优势有关。结论部分翻译如下：尽管使用壳聚糖颗粒实现了77.5%的蝰科蛇毒包封，该聚合物仍具有作为生物可降解药物载体的有趣特性，其在水系统中的不溶性可能是未实现100%包封的原因。然而，通过离子凝胶法成功包封了L. acrochorda（La）、B. ayerbei（Bay）、B. rhombeatus（Br）和B. asper（Bas）的蛇毒。HPLC、电子显微镜、多分散指数和红外光谱的实施证实了蛇毒加载到纳米颗粒中。使用壳聚糖-蛇毒纳米颗粒获得的兔抗体显示出与不完全弗氏佐剂和氢氧化铝产生的免疫反应相似或略好（p<0.1817）但无显著差异的免疫原性反应，表明壳聚糖纳米颗粒可用作替代免疫佐剂。此外，基于ELISA和Western blot结果，使用壳聚糖-蛇毒纳米颗粒获得的兔抗体能识别La、Bay、Br和Bas中含量较少的毒素，而这些毒素未被使用不完全弗氏佐剂和氢氧化铝免疫的蝰科蛇毒抗体识别。另外，壳聚糖纳米颗粒具有无毒性，因为在兔免疫期间未诱导炎症；即壳聚糖-蛇毒纳米颗粒在免疫过程中未产生皮肤损伤，也未出现像使用不完全弗氏佐剂和氢氧化铝免疫蛇毒时那样的局部皮肤肿块。壳聚糖纳米颗粒策略必须通过一些医学安全的化学修饰来提高此类蝰科蛇毒的包封效率。因此，使用蛇毒包封的壳聚糖纳米颗粒已被证明是抗蛇毒血清生产的替代生物技术方法。